查耳酮衍生物的合成及联合氟康唑抗耐药白色念珠菌活性

沈云虹，陈红洁，毛泽伟，黄正晓，虎春艳

（云南中医药大学中药学院，昆明 650500）

白色念珠菌是一种在大多数人的胃肠黏膜、生殖道、口腔和皮肤上无症状定植的真菌。氟康唑（fluconazole, FLC）是临床上治疗白色念珠菌感染的首选药物，但随着FLC 的广泛使用，其耐药情况越来越严重。目前在克服真菌耐药的研究中，联合用药已成为一种新的用药模式[1-2]。

查耳酮是一类广泛存在于多种中草药中的活性成分，具有多种生物活性，如抗菌、抗炎、抗肿瘤和抗氧化等[3-5]。本研究小组在前期对查耳酮类化合物开展了大量的构效关系研究[6-10]，以及协同抗真菌药物发挥抗耐药真菌活性的研究[11-12]。本文在前期研究基础上，从乙酰乙酸乙酯与水杨醛为原料出发，合成得到8 个新的香豆素-查耳酮类衍生物5a ～ 5h，采用微量稀释法对其体外联合FLC抗耐药白色念珠菌作用进行评价，衍生物合成路线见图1。

Figure 1 Synthesis of coumarin-chalcone derivatives

1 合成路线

香豆素-查耳酮类衍生物合成路线见图1。对氟苯乙酮与哌嗪反应后生成化合物1，化合物1 与不同结构的芳香醛通过Claisen-Schmidt 缩合反应生成8 个查耳酮类化合物2a ～ 2h。由乙酰乙酸乙酯和水杨醛发生Knoevenagel 反应后，再与单质溴反应合成溴代香豆素，最后将8个查耳酮类化合物2a ～ 2h 与溴代香豆素结合，合成了8 个新化合物5a ～ 5h。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

AM-400 核磁共振波谱仪（德国Bruker 公司，TMS 为内标）；Plus384 酶标仪（美国Molecular Devices公司）。

白色念珠菌FLC 敏感株SC5314（云南登楼科技有限公司）；白色念珠菌氟康唑耐药株SC5314-FR（用FLC诱导敏感菌SC5314使其对FLC耐药）。

氟康唑分散片（南昌弘益药业有限公司）；硅胶薄层预制板（GF254）、柱色谱硅胶（青岛海洋化工有限公司）；其余试剂和溶剂均为市售分析纯。

2.2 合成部分

2.2.1 中间体化合物1的合成 称取4-氟苯乙酮（2.76 g，20 mmol）、哌嗪（5.17 g，60 mmol）和无水碳酸钾（5.52 g，40 mmol）于100 mL圆底烧瓶中，加入无水乙腈50 mL，95 ℃回流反应12 h。TLC 检测反应完成后，加入二氯甲烷200 mL中，以水洗涤萃取后（200 mL × 3），二氯甲烷层经无水硫酸钠干燥、过滤、真空浓缩后柱色谱，以二氯甲烷-甲醇（100∶1→50∶1）溶液为洗脱剂，分离得到3.31 g 化合物1，重量收率81%。

2.2.2 中间体化合物2a ～ 2h 的合成 称取制备的化合物1（0.20 g，1 mmol）和不同取代基的醛（1.1 mmol）于25 mL 圆底烧瓶中，加入甲醇5 mL溶解后，再加入20%氢氧化钾水溶液，室温下反应12 h。TLC 检测反应完全后，将反应物倒入冷水10 mL中，搅拌5 min，用二氯甲烷萃取3次（10 mL ×3）。合并二氯甲烷层，无水硫酸钠干燥、过滤、真空抽滤浓缩后，以二氯甲烷-甲醇（100∶1）溶液为洗脱剂进行柱色谱，分离得到化合物2a ～ 2h，重量收率70% ～ 80%。

2.2.3 中间体化合物3的合成 称取乙酰乙酸乙酯（2.60 g，20 mmol）和水杨醛（2.44 g，20 mmol）于100 mL 圆底烧瓶中，加入无水乙醇25 mL 和哌啶5 滴，室温反应3 h。TLC 检测反应完成后，真空抽滤，以95%乙醇50 mL 重结晶，得到3.3 g 化合物3，重量收率88%。

2.2.4 中间体化合物4 的合成 称取制备的化合物3（1.88 g，10 mmol）于50 mL 圆底烧瓶中，加入冰醋酸20 mL，搅拌下缓慢滴加Br2（0.5 mL，10 mmol）的冰醋酸（5 mL）溶液，室温反应5 h。TLC 检测反应完全后，加热到55 ℃继续反应30 min，固体溶解并排除HBr 气体，冷却析晶，抽滤，滤饼用无水乙醚洗两次后干燥，再以冰醋酸20 mL 重结晶，抽滤，无水乙醚洗涤滤饼2 次，得到化合物4白色针状晶体1.98 g，重量收率75%。

2.2.5 目标化合物5a ～ 5h 的合成 称取化合物2a ～ 2h（0.3 mmol）和化合物4（80 mg，0.3 mmol）于10 mL圆底烧瓶中，加入二氯甲烷（5 mL）和二异丙基乙胺（DIPEA，0.7 mL，0.6 mmol），室温下反应3 h，TLC 检测反应完成后，加水5 mL 继续搅拌5 min，萃取，二氯甲烷层真空抽滤浓缩后，柱色谱分离纯化，以二氯甲烷-甲醇（200∶1）溶液为洗脱剂，得到目标化合物5a ～ 5h，见表1（表1 中收率为重量收率）。

Table 1 Structure and yield of derivatives 5a-5h

化合物5a 黄色固体。1H NMR (400 MHz,CDCl3)δ: 8.54(1H, s, CH), 7.99(2H, d,J= 8.0 Hz,Ar-H), 7.74 (1H, s, Ar-H), 7.55 ～ 7.65(2H, m, Ar-H, CH＝CH), 7.26 ～ 7.37(4H, m, Ar-H, CH＝CH),6.70(2H, d,J= 8.0 Hz, Ar-H), 6.67(3H, d,J= 8.0Hz, Ar-H ), 4.03(2H, s, COCH2), 3.43(4H, t,J= 8.0 Hz, NCH2), 3.02(6H, s, NCH3), 2.79 (4H, t,J= 4.0 Hz, NCH2);13C NMR (101 MHz, CDCl3)δ: 194.5,188.4, 159.4, 155.5, 152.1, 147.9, 144.3, 134.7,130.0, 123.4, 117.3, 116.7, 113.6, 112.1, 67.2,53.3, 47.4, 40.2。

化合物5b 黄褐色固体。1H NMR (400 MHz,CDCl3)δ: 8.55(1H, s, CH), 7.98(2H, d,J= 8.0 Hz,Ar-H), 7.89(1H, s, Het-H), 7.67(2H, s, Het-H), 7.37(4H, s, Ar-H), 7.31 ～ 7.34(3H, m, Ar-H, CH＝CH),7.07(1H, d,J= 4.0 Hz, Ar-H), 6.92(2H, d,J= 8.0Hz, Ar-H), 4.04(2H, s, COCH2), 3.45(4H, t,J= 4.0 Hz, NCH2), 2.80(4H t,J= 8.0 Hz, NCH2);13C NMR(101 MHz, CDCl3)δ: 194.5, 187.5, 159.1, 155.5,154.3, 147.8, 141.0, 135.9, 134.7, 130.7, 130.1,128.4, 124.3, 121.1,117.1, 113.7, 67.2, 53.1, 47.4。

化合物5c 淡黄色固体。1H NMR (400 MHz,CDCl3)δ: 8.55(1,H s, CH), 8.00 (2H, d,J= 8.0 Hz,Ar-H), 7.74(1H, s, Ar-H), 7.65 ～ 7.69(2H, m, Ar-H,CH＝CH), 7.49 ～ 7.55(3H, m, Ar-H, CH＝CH),7.34 ～ 7.40(2H, m, Ar-H,), 7.22(2H, d,J= 8.0 Hz,Ar-H), 6.86 (d,2H,J= 8.4 Hz, Ar-H), 4.04(2H, s,COCH2), 3.45(4H, t,J= 8.0 Hz, NCH2), 2.80(4H, t,J= 8.0 Hz, NCH2), 2.39(3H, s, CH3);13C NMR (101MHz, CDCl3)δ:194.5, 188.2, 159.5, 155.3, 154.2,148.1, 140.8, 134.7, 130.2, 129.5, 128.6, 124.4,121.2, 116.8, 113.5, 67.4, 53.1, 47.5, 21.4。

化合物5d 浅黄色固体。1H NMR (400 MHz,CDCl3)δ: 8.57(1H, s, CH), 8.00(2H, d,J= 12.0 Hz,CH＝CH), 7.66 ～ 7.72(3H, m, Ar-H), 7.33 ～ 7.44(6H, m, Ar-H), 6.91 ～ 7.00(3H, m, Ar-H), 4.05(2H,s, COCH2), 3.94(3H, s, OCH3), 3.46(4H, t,J= 4.0 Hz, NCH2), 2.80(4H, t,J= 4.0 Hz, NCH2);13C NMR(101 MHz, CDCl3)δ: 196.1, 189.9, 164.3, 159.1,156.7, 154.1, 149.6, 143.1, 134.7, 130.8, 130.3,128.8, 128.2, 125.2, 123.0, 120.7, 117.7, 116.9,114.5, 113.8, 61.4, 55.1, 53.1, 48.0。

化合物5e 浅黄色固体。1H NMR (400 MHz,CDCl3)δ: 8.62(1H, s, CH) 8.00(2H, d,J= 8.0 Hz,Ar-H), 7.66 ～ 7.71(3H, m, Ar-H, CH＝CH), 7.26 ～7.45(3H, m, Ar-H), 6.93(2H, d,J= 8.0 Hz, Ar-H),6.86(2H, s, Ar-H), 4,04(2H, s, COCH2), 3.92(6H, s,OCH3), 3.89(3H, s, OCH3),3.45(4H, t,J= 4.0 Hz,NCH2), 2.80(4H, t,J= 8.0 Hz, NCH2);13C NMR(101 MHz, CDCl3)δ: 194.5, 188.2, 159.2, 155.4,154.2, 153.6, 148.1, 143.5, 140.2, 134.8, 140.2,134.8, 131.0, 130.8, 130.4, 128.5, 125.3, 124.2,121.6, 118.3, 117.0, 113.7, 105.6, 67.2, 61.2,56.4, 53.1, 47.4。

化合物5f 浅黄色固体。1H NMR (400 MHz,CDCl3)δ: 8.62(1H, s, CH) 8.01(2H, d,J= 12.0 Hz,CH＝CH), 7.67 ～ 7.76(3H, m, Ar-H), 7.33 ～ 7.44(3H, m, Ar-H), 7.16 ～ 7.25(4H, m, Ar-H), 6.94(2H,t,J= 12.0 Hz, Ar-H), 4.05(2H, s, COCH2), 3.96(6H, d,J= 8.0 Hz, OCH3), 3.45(4H, t,J= 4.0 Hz,NCH2), 2.80(4H, t,J= 4.0 Hz, NCH2);13C NMR(101 MHz, CDCl3)δ: 194.2, 189.6, 149.3, 148.1,143.5, 134.8, 130.7, 130.4, 128.7, 128.5, 125.3,122.9, 120.2, 116.9, 113.8, 111.3, 110.2, 56.1,56.1, 53.2, 47.5。

化合物5g 浅黄色固体。1H NMR (400 MHz,CDCl3)δ: 8.60(1H, s, CH) 8.00(2H, d,J= 8.0 Hz,Ar-H), 7.66 ～ 7.71(3H, m, Ar-H, CH＝CH), 7.52(1H, d,J= 16.0 Hz, Ar-H), 7.35 ～ 7.41(2H, m, Ar-H), 6.93(2H, d,J= 8.0 Hz, Ar-H), 6.78(2H, s, Ar-H), 6.52(1H, t,J= 4.0 Hz, Ar-H), 4, 05(2H, s,COCH2), 3.84(6H, d,J= 8.0 Hz, OCH3), 3.46(4H, t,J= 4.0 Hz, NCH2), 2.80(4H, t,J= 4.0 Hz, NCH2);13C NMR (101 MHz, CDCl3)δ: 199.3, 188.2, 161.2,154.3, 148.1, 143.3, 137.4, 134.8, 130.9, 130.4,128.4, 125.3, 124.3, 122.7, 118.4, 116.9, 113.7,106.3, 102.5, 67.2, 55.6, 53.1, 47.4。

化合物5h 黄色固体。1H NMR (400 MHz,CDCl3)δ: 8.50(1H, s, CH), 7.93(2H, d,J= 8.0 Hz,Ar-H), 7.59 ～ 7.68(3H, m, Ar-H, CH＝CH), 7.44 ～7.51(3H, m, Ar-H), 7.19 ～ 7.34(4H, m, Ar-H), 6.86(2H, d,J= 8.0 Hz, Ar-H),3.98(2H, s, COCH2), 3.39(4H, t,J= 4.0 Hz, NCH2), 2.73(4H, t,J= 4.0 Hz,NCH2);13C NMR (101 MHz, CDCl3)δ: 188.7, 182.0,155.4, 154.3, 148.1, 141.8, 136.1, 134.8, 130.9,130.4, 129.6, 129.3, 125.3, 122.6, 118.4, 116.9,113.7, 67.2, 53.1, 47.3。

2.3 目标化合物体外抗白色念珠菌活性

采用微量稀释法测试目标化合物的体外抗白色念珠菌活性。阳性对照药物FLC 和目标化合物分别溶于DMSO，超声10 min，离心取上清液，储存浓度为50 mg/mL，4 ℃冰箱密封保存。取96 孔培养板，目标化合物及FLC 均稀释成初始浓度为200 µg/mL，6 个浓度梯度，每个浓度梯度3 个重复孔，每孔100 µL，进行5 倍倍比稀释。菌株活化2 次后制备菌悬液，每孔加入真菌菌悬液100 µL，使白色念珠菌的终浓度为1 × 105CFU/mL，按照对照组、FLC 组、化合物组、化合物+FLC 组，微量稀释法加入对应药物进行梯度稀释，分别加入真菌悬液，SC5314 于30 ℃恒温培养箱内孵育24 h，SC5314FR 于37 ℃恒温培养箱内孵育24 h。酶标仪测定625 nm 下的吸收度，计算联合指数（FICI）。FICI = MICA/A+MICB/B（式中A 和B 分别为两药单用时的MIC，MICA 和MICB 分别为两药联合时的MIC）。当MIC 高于检测最高限时，以最高限浓度的两倍用以计算FICI。实验同时设置培养基空白对照、菌液对照以及FLC 阳性药物对照。本实验中MIC50的计算以FLC 的最小真菌生长50%时的抑制百分数来计算。当FICI ≤ 0.5 时，两药的作用方式为协同；当0.5 ＜ FICI ≤ 4时，两药的作用方式为无关；当FICI ＞ 4时，两药的作用方式为拮抗。

3 结果与讨论

3.1 目标化合物的合成

中间体2 和4 参照文献合成[9-10]。目标化合物5a ～ 5h 的合成路线如图1 所示，前期研究和文献报道[11-12]，N-杂环化合物和α-卤代酮的反应常用的催化剂有K2CO3和DIPEA，但在合成目标化合物5时，用碳酸钾催化反应，反应速度较慢、转化率低且副产物相对较多，DIPEA 催化反应时，反应速度更快，副产物相对少，转化率也较高，因而采用DIPEA催化合成目标化合物5a ～ 5h。

3.2 抗白色念珠菌活性

从表2 中可以看出，化合物5a ～ 5h 单用时对白色念珠菌氟康唑敏感株SC5314和白色念珠菌氟康唑耐药株SC5314-FR 都没有抑制活性。但当其与FLC 联用时对白色念珠菌耐药株SC5314-FR 表现出了很好的协同抑制活性，特别是化合物5e 和5g的MIC50分别为15.82和5.60 µg/mL。从衍生物结构上来看，查耳酮A 环上含有供电子基团（Me2N, CH3, CH3O）时活性较优，并以甲氧基取代时活性最强，且取代基数量越多协同抗菌作用越强，而含有卤素（Cl）取代时活性会降低。

分级抑菌浓度指数（FICI）为抗菌药药效学参数之一，是用来评判两种抗菌药物相互作用方式的标准。从表2可以看出，在合成的8个衍生物中，有7个化合物（5a ～ 5g）与FLC联用时对白色念珠菌耐药株SC5314-FR 的FICI 为0.03 ～ 0.35 µg/mL，表明香豆素-查耳酮衍生物与FLC通过协同作用发挥抗菌活性。由此看出，该类衍生物可作为抗真菌药物的增效剂。

Table 2 In vitro antifungal activity of 5a-5h against Candida albicans

4 结 论

本研究设计合成了8 个香豆素-查耳酮衍生物，体外活性实验研究表明，该类衍生物能协同FLC发挥抗耐药真菌活性，可作为抗真菌药物增效剂，更多抗菌机制和体内活性研究正在进行中。