IL-33通过TGF-β1/Smad3信号通路调控CES诱导细胞上皮-间质转化的机制研究*

梁小波,蓝 楠,张 沄,王宋平,李玉英

(西南医科大学附属医院呼吸与危重症医学科/炎症与变态反应实验室,四川泸州 646000)

慢性阻塞性肺疾病(简称慢阻肺)是一种以持续存在的呼吸系统症状和气流受限为特征的慢性炎症性疾病[1]。肺功能检查是目前诊断和评估该疾病严重程度的重要手段,香烟烟雾等导致的气道重塑在慢阻肺患者肺功能下降过程中扮演着重要角色,上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)在气道重塑的发生、发展过程中也起着关键作用[2-3]。白细胞介素(IL)-1超家族和转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-母亲信号蛋白同源物(mothers against decapentaplegic homologs,Smad)超家族与慢阻肺、支气管哮喘、肺纤维化等多种肺部疾病的发生、发展相关,这些肺部疾病在发生机制上都存在EMT,IL-33信号通路和TGF-β1信号通路在EMT发生、发展过程中是否存在相互作用目前并不清楚[4-6]。因此,探索IL-33在烟草提取物(cigarette smoke extracts,CSE)诱导EMT发生过程中的具体作用及IL-33/肿瘤发生抑制蛋白2(suppression of tumorigenicity 2,ST2)、TGF-β1/Smad3信号通路之间的关联,对于进一步阐明慢阻肺的潜在细胞分子机制有着重要意义。本研究探讨IL-33在CSE诱导细胞EMT形成过程中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人支气管上皮细胞(16HBE)来源于西南医科大学附属医院炎症与变态反应实验室;天下秀(金)香烟购自川渝中烟公司;ST2、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、Smad3、磷酸化Smad3(phosphorylation of Smad3,p-Smad3)抗体购自英国Abcam公司,波形蛋白(Vimentin)、TGF-β1、β-actin抗体购自美国Santa Cruz公司;人IL-33抗体购自美国R&D公司;重组人IL-33购自美国PeproTech公司;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶配制试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液购自上海碧云天生物技术有限公司;Western blot检测试剂盒及IP裂解液购自美国Thermo公司;垂直电泳槽、ECL化学发光底物、凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司;聚偏氟乙烯(PVDF)膜购自美国Millipore公司;二氧化碳培养箱购自日本SANYO公司;激光共聚焦显微镜购自德国Leica公司。

1.2 方法

1.2.1CSE制备

根据参考文献[7]制备CSE,依次点燃2支去过滤嘴香烟,负压泵吸引下香烟烟雾通过装有4 mL PBS的收集瓶,待烟雾溶解充分后,利用0.22 μm过滤器除去大颗粒物质和细菌,1 mol/L NaOH将CSE的pH调至7.2～7.4。每次实验前30 min新鲜制备。

1.2.2细胞培养和分组

将细胞分为对照组、CSE组、CSE+Anti-IL-33组、CSE+IL-33组。根据参考文献[7-9]进行细胞培养和刺激,细胞在含有10%胎牛血清的完全培养基中生长到70%融合度时,按照实验分组分别给予PBS、5% CSE、5% CSE+Anti-IL-33(3 μg/mL)、5% CSE+IL-33(40 ng/mL)刺激,继续置于37 ℃、5%CO2培养箱内培养72 h,收集细胞。

1.2.3各组细胞E-cadherin、Vimentin荧光强度

各组细胞刺激72 h后用甲醛固定,0.2% TritoX-100溶液作用15 min,1%牛血清白蛋白(BSA)室温封闭30 min,E-cadherin、Vimentin一抗孵育过夜,二抗室温避光作用2 h,DAPI室温作用5 min,激光共聚焦显微镜观察拍照后进行荧光强度分析。

1.2.4各组细胞E-cadherin、Vimentin、ST2、TGF-β1、p-Smad3、Smad3蛋白表达

刺激72 h后收集各组细胞,提取细胞总蛋白,根据参考文献[7]进行Western blot检测,凝胶成像仪曝光并提取图片,AlphaEaseFC软件分析目的条带相对灰度值。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 各组细胞E-cadherin、Vimentin荧光强度比较

与对照组比较,CSE暴露后干预各组细胞E-cadherin荧光强度减弱,Vimentin荧光强度增强,差异有统计学意义(P<0.05)。与CSE组比较,CSE+Anti-IL-33组E-cadherin荧光强度增强,Vimentin荧光强度减弱,CSE+IL-33组E-cadherin荧光强度减弱,Vimentin荧光强度增强,差异有统计学意义(P<0.05),见图1。

A:E-cadherin荧光强度;B:E-cadherin荧光强度组间比较;C:Vimentin荧光强度;D:Vimentin荧光强度组间比较;①:对照组;②:CSE组;③:CSE+Anti-IL-33组;④:CSE+IL-33组;a:P<0.05,与对照组比较;b:P<0.05,与CSE组比较。

2.2 各组细胞E-cadherin、Vimentin、ST2蛋白表达比较

与对照组比较,CSE暴露后干预各组细胞E-cadherin蛋白表达降低,Vimentin、ST2蛋白表达升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与CSE组比较,CSE+Anti-IL-33组E-cadherin蛋白表达升高,Vimentin、ST2蛋白表达降低,CSE+IL-33组E-cadherin蛋白表达降低,Vimentin、ST2蛋白表达升高,差异有统计学意义(P<0.05),见图2。

A:Western blot检测E-cadherin、Vimentin、ST2表达;B～D:分别为E-cadherin、Vimentin、ST2表达水平组间比较;①:对照组;②:CSE组;③:CSE+Anti-IL-33组;④:CSE+IL-33组;a:P<0.05,与对照组比较;b:P<0.05,与CSE组比较。

2.3 各组细胞TGF-β1、p-Smad3蛋白表达比较

与对照组比较,CSE暴露后干预各组细胞TGF-β1、p-Smad3蛋白表达升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与CSE组比较,CSE+Anti-IL-33组TGF-β1、p-Smad3蛋白表达降低,CSE+IL-33组TGF-β1、p-Smad3蛋白表达升高,差异有统计学意义(P<0.05),见图3。

A:Western blot检测TGF-β1、p-Smad3表达;B、C:分别为TGF-β1、p-Smad3表达水平组间比较;①:对照组;②:CSE组;③:CSE+Anti-IL-33组;④:CSE+IL-33组;a:P<0.05,与对照组比较;b:P<0.05,与CSE组比较。

3 讨 论

慢阻肺已成为全球三大死亡原因之一,吸烟仍然是慢阻肺的主要危险因素,长期暴露于香烟烟雾等有害颗粒或气体中会导致慢阻肺患者肺功能的进行性下降,严重影响患者的预后和生活质量[1,10]。气道重塑是引起慢阻肺患者肺功能下降的重要原因之一,EMT在气道重塑的发生、发展过程中起着关键作用[2-3]。EMT是由一组保守的诱导信号、转录调节器和下游效应器驱动的细胞组织从上皮表型转化为间质表型的动态过程,其中TGF-Smad家族的信号具有主导作用,其结果表现为E-cadherin、Occludin等上皮细胞蛋白表达下调,Vimentin、Fibronectin等间质细胞蛋白表达上调,使上皮细胞顶底极性丧失、运动能力增强[11-12]。

既往研究表明[13-14],CSE可以在人支气管上皮细胞、人小气道上皮细胞、Ⅱ型肺泡上皮细胞中诱导EMT的形成。进一步研究发现[15],在屋尘螨提取物处理的肺泡上皮细胞中,IL-33可以刺激CD146表达,进而促进慢性过敏性气道炎症的EMT形成。尽管CSE已被证实可以诱导多种肺上皮细胞EMT的形成,但是其在慢阻肺气道重塑中的作用机制仍未阐明。

IL-33属于IL-1趋化因子超家族成员,定位于细胞核并充当基因调节因子,在细胞损伤、应激、死亡时细胞核释放,IL-33的N末端被裂解后才能获得完全的生物活性,它需要与细胞膜上的ST2结合从而发挥促炎生物学功能[6]。既往研究显示,在慢阻肺患者及香烟诱导的慢阻肺小鼠模型中IL-33和ST2的表达升高,而抗IL-33抗体可以减轻香烟诱导的慢阻肺小鼠模型病理改变[16-17]。有研究发现,IL-33的表达与慢阻肺患者疾病的严重程度呈正相关,与第1秒用力呼气容积占预计值百分比(FEV1%)呈负相关[18]。但是IL-33/ST2信号通路在慢阻肺气道重塑的发生、发展过程中的作用机制尚不清楚。本研究显示,与对照组比较,CSE暴露可以诱导细胞发生EMT,主要表现为上皮细胞标志物E-cadherin荧光强度减弱,间质细胞标志物Vimentin荧光强度增强,Anti-IL-33可以抑制CSE诱导细胞EMT的改变,而IL-33可以促进这种变化。在Western blot实验中进一步验证了上述结果。同时发现,与对照组比较,CSE暴露后细胞IL-33特异性受体ST2蛋白表达升高,Anti-IL-33可以抑制CSE诱导细胞ST2蛋白表达,而IL-33可以与CSE协同作用进一步升高ST2蛋白表达。根据以上研究结果,笔者推测IL-33可能通过IL-33/ST2轴促进CSE诱导细胞EMT的形成。

TGF-β与其胞膜受体结合后可使Smad2/Smad3发生磷酸化,后者与Smad4形成异源复合物转位入核,调节基因转录,参与调控细胞增殖、分化、迁移和凋亡[19]。本研究结果显示,与对照组比较,CSE暴露后细胞TGF-β1及其下游信号分子p-Smad3蛋白表达升高,Anti-IL-33可以明显抑制CSE暴露引起的TGF-β1、p-Smad3蛋白表达,IL-33可以促进CSE暴露引起的TGF-β1、p-Smad3蛋白表达。根据上述实验结果,笔者推测IL-33信号通路与TGF-β1信号通路在慢阻肺EMT形成过程中可能的作用机制:IL-33可能通过上调气道上皮细胞TGF-β1、p-Smad3蛋白表达,从而促进CSE诱导的EMT形成。

综上所述, IL-33可能通过IL-33/ST2轴上调TGF-β1/Smad3信号通路,促进CSE诱导细胞EMT的形成,但是它们在慢阻肺患者体内是否存在着相同的作用,以及IL-33是否会成为慢阻肺潜在的治疗靶点还需进一步研究。