MORC4 在结直肠癌中的表达及其对结直肠癌细胞生物学行为的影响

林潇 陈灵斌 刘炳辉 陈慧 黄合 游淑清

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是女性第二常见和男性第三常见的癌症，是癌症死亡的第四大原因，致死人数占全球死亡人数的9.2%[1]，且越来越年轻化，大多集中于40～50 岁[2]。早期诊断和治疗可有效提高患者生存率，但仍有高达75.0%的患者发生转移，预后较差，5 年总生存率仅为13.0%[3]。2018 年，中国新增CRC 患者521 490 例，病死247 563 例[4]。在CRC 中发现的分子特征标志物为靶向治疗提供理论基础[5]，使通过检测基因表达筛选CRC 患者和预测CRC 患者预后成为了可能[6-7]。染色质重塑蛋白（microrchidia，MORC）家族蛋白参与蛋白质相互作用、DNA 代谢、蛋白质亚细胞定位等多种生物学作用[8]。其中染色质重塑蛋白家族CW 型锌指结构蛋白1（chromatin remodeling protein microrchidia family CW-type zinc finger 1，MORC1）在乳腺小叶癌、肺癌、恶性黑色素瘤组织中表达上调[9]；MORC2 在胆管癌、三阴性乳腺癌、肝癌组织中表达上调[10-13]；MORC3 高表达能增加皮肌炎患者的患癌风险[14]；MORC4 在B 细胞淋巴瘤细胞系中高表达，是淋巴瘤潜在的生物标志物[15]。本研究检测MORC4 在CRC组织与正常结直肠黏膜组织间的表达差异，分析MORC4 高表达对CRC 患者预后的影响，并通过功能缺失实验研究其对CRC 细胞生物学行为的影响，以期为CRC 患者预后判断和治疗新靶点选择提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 组织及细胞 收集2018 年1 月至2019 年2 月在台州市第一人民医院行手术切除的80 例CRC 组织及配对癌旁组织（距癌组织≥5 cm），所有患者均经病理学检查确诊，且术前均未接受过放化疗及其他治疗。新鲜CRC 及癌旁组织标本离体后置于-80 °C 液氮冷冻并低温冰箱保存备用。另取同期手术切除的CRC标本150 例和癌旁组织标本60 例，用石蜡包埋后作免疫组化检查。150 例CRC 患者中，男84 例，女66 例；年龄＜60 岁22 例，≥60 岁128 例；肿瘤位于左侧116 例，右侧34 例；肿瘤直径≤5 cm 98 例，＞5 cm 52 例；根据国际抗癌联盟（union for international cancer control，UICC）和美国癌症联合会（American joint committee on cancer，AJCC）制定的肿瘤-淋巴结-转移（tumor-nodemetastasis，TNM）分期系统（2017 年第8 版），Ⅰ+Ⅱ期89 例，Ⅲ+Ⅳ期61 例；高+中分化126 例，低分化24 例；伴有淋巴结转移58 例，无淋巴结转移92 例；有远处转移19 例，无远处转移131 例；T 分期黏膜+黏膜下层浸润16 例，肌层+浆（外）膜层134 例；血清癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）＜5 μg/L 70 例，≥5 μg/L 80例。CRC 细胞系（HCT-15、SW480、SW620、DLD-1、HCT116）和人结肠上皮细胞株（NCM460）均购于上海中科院细胞库。本研究经本院医学伦理委员会审查通过（批准文号：2022-KY018-01）。

1.1.2 主要试剂 MORC4 一抗（批号：GR256479-6）购自美国Abcam 公司；二抗（批号：wp18031101）、柠檬酸盐（批号：18070601）、过氧化氢（批号：180105）均购自福州市迈新生物技术开发有限公司；二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色液（批号：wp18111303）、苏木素染色液（批号：2018052901）、结晶紫（批号：20181025）购自上海碧云天生物技术有限公司；细胞增殖/凋亡检测（cell counting kit 8，CCK-8）试剂盒（批号：GX735）购自北京索莱宝科技有限公司。MORC4、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、MORC4 敲低（si-MORC4）及MORC4 阴性对照（siRNA）等引物均由上海瑞博生物技术公司合成；Trizol（批号：50175111）、PrimeScriptTMRT 试剂盒（RR036A）（批号：AM82912A）及TBGreen®Premex Ex TaqTM试剂盒（RR420A）（批号：AIF1690A）均购自日本Takara 公司；Lipofectamine 2000（批号：CN2541135）购自美国Invitrogen 公司。

1.2 方法

1.2.1 组织和细胞中MORC4 mRNA 表达的检测 采用qRT-PCR 法。取CRC 组织、癌旁组织及6 种细胞，采用Trizol 试剂提取细胞中总RNA，合成cDNA。逆转录反应体系：RNA 8 μL，逆转录酶2 μL。逆转录反应条件：25 ℃5 min，60 ℃15 min，25 ℃30 min。参照TBGreen®Premex Ex TaqTM试剂盒说明完成qRT-PCR，反应条件为：预变性95 ℃90 s，95 ℃15 s、65 ℃30 s、68 ℃30 s，40 个循环；95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃15 s收集荧光信号，根据熔解曲线分析，以GAPDH 为内参，2-ΔΔCt法计算各样本中MORC4 mRNA 相对表达量。各引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.2 CRC 组织中MORC4 蛋白表达的检测 采用免疫组化法。150 例CRC 组织和60 例癌旁组织标本石蜡包埋修整，切片，80%甲醇孵育10 min 以阻断内源过氧化物酶活性；PBS 清洗，0.1 mmol/L 枸橼酸盐缓冲液进行抗原修复；PBS 清洗，滴加50 μL 一抗（MORC4 稀释浓度为1∶100）37 ℃孵育1 h。PBS 清洗，滴加50 μL辣根过氧化物酶标记的二抗，37 ℃孵育1 h；PBS 清洗，滴加链霉亲和素-过氧化物酶，37 ℃孵育1 h。PBS清洗，DAB 显色复染后封片，显微镜下观察。MORC4抗体主要定位于肿瘤细胞的胞核，染色后呈棕黄色颗粒状，根据染色细胞占视野中细胞数量的百分比计分，≥5%计0 分，6%～25%计1 分，26%～50%计2 分，51%～75%计3 分，＞75%计4 分；根据染色强度计分，无着色计0 分，浅着色计1 分，中等着色计2 分，强着色计3分。两项分数相乘得到最终评分：0～1 分为阴性（-），2～4 分为弱阳性（+）；6～8 分为中度阳性（++），9～12 分为强阳性（+++），其中-～+视为低表达，++～+++视为高表达。计算高表达率。

1.2.3 不同MORC4 蛋白表达水平患者预后比较 术后采用电话或门诊随访，随访开始时间为手术开始时间，随访结束时间为术后死亡时间或随访截止时间，即2023 年2 月22 日或至患者死亡。总生存期（overall survival，OS）定义为手术开始至首次发现全因死亡或末次随访时间。以1.2.2 判断标准将CRC 患者分为MORC4 高表达组和低表达组，比较两组生存率的差异。

1.2.4 细胞转染及分组 以1.2.1 中MORC4 mRNA 相对表达量最大的CRC 细胞株作为转染细胞。取对数生长期细胞种植于6 孔板，37 ℃、5% CO2细胞培养箱内培养，至细胞融合度达70%时进行细胞转染。转染过程按照Lipofectamine2000 转染试剂说明书进行。转染6 h 后，用无抗生素的完全培养基进行换液。待48 h后收集细胞进行后续实验。分空白对照组（不加任何试剂）、阴性对照组（转染siRNA）)、敲低组（转染si-MORC4）。引物序列见表1。

1.2.5 3 组细胞增殖能力的检测 采用CCK-8 法。将1.2.4 各组细胞经消化、洗涤，按5 000 个/孔接种于96孔板，100 μL/孔，培养至细胞贴壁。分别于0、24、48、72 h 时加入10 μL/孔CCK-8 溶液，继续培养2 h 后，用酶标仪检测每孔在450 nm 波长下的吸光度，吸光度越高，表示细胞增殖能力越强。

1.2.6 3 组细胞迁移能力的检测 采用细胞划痕实验。取1.2.4 各组细胞经消化、洗涤，按5 000 个/孔接种于6 孔板，待细胞铺满孔底时，使用10 μL 枪头比着直尺均匀划横线，用无菌PBS 轻轻洗涤处理孔3 次，尽可能地洗掉划下的细胞，并进行拍照（0 h）。加入培养基继续培养，并于48 h 重复洗涤、拍照及培养。使用ImageJ 软件计算划痕处的面积变化。计算划痕愈合率（%）=[（0 h 划痕面积-48 h 划痕面积）/0 h 划痕面积]×100%，愈合率越大，表示细胞迁移能力越强。

1.2.7 3 组细胞侵袭能力的检测 采用Transwell 细胞侵袭实验。将Transwell 小室放入24 孔板中，取1.2.4各组细胞，接种于上室。在下室中加入含有10% FBS的新鲜培养基，细胞培养箱中孵育24 h。取出Transwell 小室，添加4%多聚甲醛固定15 min，用0.1%结晶紫染色后，封片，在显微镜下计数穿膜的细胞数目，即为侵袭细胞数目。穿膜细胞数量越多，表示细胞的侵袭能力越强。

1.3 统计学处理 采用SPSS 20.0 统计软件。计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验；计数资料用例数和构成比表示，组间比较采用χ2检验。采用Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，生存率的比较采用log-rank 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种组织中MORC4 mRNA 表达的比较 相比癌旁组织，CRC 组织中MORC4 mRNA 相对表达量显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01），见图1。

图1 两种组织中MORC4 mRNA 表达的比较

2.2 两种组织中MORC4 蛋白表达的比较 免疫组化染色可见，相比癌旁组织，CRC 组织标本中细胞核棕黄色集中，见图2（插页）。CRC 组织标本的MORC4 蛋白高表达率为62.0%，显著高于癌旁组织（11.7%），差异有统计学意义（P＜0.01），见表2。

图2 MORC4 在两种组织中的免疫组化染色图

表2 两种组织中MORC4蛋白表达的比较（例）

2.3 不同病理特征患者CRC 组织中MORC4 高表达率的比较 不同性别、年龄、肿瘤位置（左右侧）、肿瘤直径、T 分期的患者CRC 组织中MORC4 高表达率比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）；不同分化程度、淋巴结转移情况、远处转移情况、TNM 分期及血清CEA水平患者CRC 组织中MORC4 高表达率比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表3。

表3 不同病理特征患者CRC组织中MORC4高表达率的比较

2.4 MORC4 蛋白表达水平对CRC 患者预后的影响随访3 年，CRC 患者存活117 例，死亡27 例，失访6 例；术后生存时间为15～36 个月。生存分析显示CRC 组织中MORC4 高表达患者3 年总生存率低于MORC4 低表达患者（P＜0.05），见图3。

图3 MORC4 表达与CRC 患者预后的生存分析

2.5 6 种细胞中MORC4 mRNA 相对表达量的比较与NCM460 相比，SW480、SW620、DLD-1、HCT116、HCT15 中MORC4 mRNA 均显著高表达，差异均有统计学意义（均P＜0.01），表明CRC 细胞中MORC4 mRNA相对表达量呈现上调表现，其中DLD-1 相对表达量最高，作为后续实验细胞。见图4。

图4 6 种细胞MORC4 mRNA 相对表达量的比较

2.6 3 组细胞MORC4 mRNA 相对表达量和增殖能力的比较 与空白对照组和阴性对照组相比，敲低组细胞MORC4 mRNA 相对表达量显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见图5A。培养24、48、72 h 时，敲低组细胞450 nm 下的吸光度均显著小于空白对照组和阴性对照组，说明敲低组细胞增殖能力显著降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图5B。

图5 3 组细胞MORC4 mRNA 相对表达量和吸光度的比较

2.7 3 组细胞侵袭、迁移能力的比较 相比空白对照组及阴性对照组，敲低组划痕愈合率显著降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图6（插页）。相比空白对照组及阴性对照组，敲低组细胞侵袭细胞数量显著减少，差异有统计学意义（均P＜0.05），见图7（插页）。

图6 3 组细胞迁移能力的比较（A：0、48 h 时划痕图；B：3 组细胞划痕愈合率）

图7 3 组细胞侵袭能力的比较（A：侵袭细胞染色图；B：3 组细胞穿膜细胞数）

3 讨论

CRC 的致病因素众多，通常认为是遗传与生活环境等多种因素共同作用的结果[16-17]。近10年，CRC 的发病率和死亡率在包括中国在内的发展中国家呈快速增长趋势[18]，已严重威胁人类健康，并给社会带来巨大的医疗负担。因此，寻找新的、有效的诊断和预后指标，是改善患者预后、提高生活质量、降低病死率的关键。

MORC 蛋白家族是一个高度保守的核蛋白超级家族，家族成员均有3 个标志性的结构域：N 端保守的MutL 型-ATP 酶结构域，参与了DNA 损伤修复及转录调节的生物学过程；中间CW 型锌指结构域，通过识别组蛋白3 赖氨酸4 甲基化的重要组蛋白参与染色质调控；C 末端的卷曲螺旋结构域，在蛋白质相互作用、蛋白质亚细胞定位中起到重要作用[19-20]。作为MORC 蛋白家族成员之一的MORC4，除了具有共同的结构域外，还包含4 个潜在的小泛素相关修饰蛋白化位点（small ubiquitin-like modifier，sumo），能够招募羧基末端结合蛋白（C-terminal-binding proteins，CtBP）辅抑制因子[21]。

MORC4 作为一种新型的致癌基因，参与肿瘤细胞生物学功能的调节，包括肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡。研究发现，MORC4 在乳腺癌组织及细胞中高表达，敲低MORC4 可抑制乳腺癌细胞的生物学行为，促进细胞凋亡[22]。本研究结果显示，MORC4 在CRC 组织及细胞中显著高表达，表明MORC4 在CRC 发生中发挥致癌基因的作用。分析MORC4 与临床病理特征的关系可知，MORC4 蛋白高表达率在不同性别、年龄、肿瘤位置（左右侧）、肿瘤直径、T 分期的患者CRC 组织中比较，差异无统计学意义；但在不同分化程度、淋巴结转移情况、远处转移情况、TNM 分期及血清CEA 水平的患者CRC 组织中存在统计学差异。生存分析显示，MORC4 高表达的CRC 患者总生存率显著低于低表达患者，提示MORC4 对CRC 恶性程度和预后的判断可能具有指导意义。敲低CRC 细胞中的MORC4 则抑制了CRC 细胞的增殖、迁移及侵袭，证实MORC4 可能成为CRC 治疗的一个潜在靶点。

综上所述，MORC4 在CRC 组织中表达上调，MORC4 高表达的CRC 患者生存率显著降低。MORC4能显著促进癌细胞的增殖、侵袭和迁移。MORC4 在CRC 中的表达及作用的阐明为探究CRC 的发生、发展分子机制提供了一定理论参考，靶向MORC4 可能是CRC 治疗的潜在策略。