葛根素对非酒精性脂肪肝小鼠糖脂代谢的影响及机制

施凯舜 徐峥 岳跃兵 黄洁

非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver，NAFL）与胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）密切相关，属于代谢应激性肝病。研究发现葛根素可有效控制NAFL 的发生、发展，使用葛根素治疗后多数NAFL 患者肝区不适、便溏、乏力等临床症状明显改善，ALT、AST 及γ-谷氨酰转肽酶（γ-glutamyl transpeptidase，GGT）活性均不同程度降低，B 超检查显示肝内回声增强减弱，肝内动静脉显示清晰，肝脏后方回声衰减较前减少，疗效较好[1-3]。本团队前期预实验发现葛根素对NAFL 小鼠模型的血脂血糖代谢、肝组织形态学均有一定程度的影响。本研究拟观察葛根素对NAFL 小鼠模型糖脂代谢及IR 的影响，进一步揭示其治疗NAFL 的药理机制，为葛根素的开发应用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物 C57BL/6 雄性小鼠50 只，16～20 g，SPF级，购于中国科学院上海实验动物中心。动物生产许可证号：SCXK2021（沪）-0062，动物使用许可证号：SYXK（沪）2021-0167。

1.1.2 主要试剂 葛根素购于西安瑞林生物科技有限公司，20 mg/瓶，粉剂，批号：202101342，加0.9%氯化钠溶液配成5 g/L 的母液，待用。脂肪酸合酶（fatty acid synthase，FAS）、过氧化物酶增殖物激活受体（peroxidase proliferator-activated receptors，PPAR）、肉毒碱棕榈酰基转移酶-1（carnitine palmityl transferase-1，CPT-1）、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK）抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体均购于美国Proteintech 生物公司，批号分别为13098-1-AP、15540-1-AP、15184-1-AP、14892-1-AP、60004-1-Ig；硬脂酰辅酶A 去饱和酶1（stearyl coenzyme a dehydrogenase-1，SCD-1）、磷酸化胰岛素受体底物1（insulin receptor substrate 1 phosphorylation，p-IRS1）、磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，p-Akt）、磷酸化糖原合成激酶3β（phosphorylated glycogen synthase kinase-3β，p-GSK3β）抗体均购于英国Abcam 抗体公司，批号分别为ab236868、ab4776、ab38449、ab93926；葡萄糖-6-磷酸酶（glucose-6-phosphatase，G-6-Pase）抗体购于北京博奥森生物技术有限公司（批号：bs-13253R）；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）蛋白上样缓冲液、电化学发光（electro-chemi-luminescence，ECL）试剂盒购于碧云天生物技术有限公司，批号分别为P0015L、P0018S；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒购于宝生物工程（大连）有限公司，批号：AIG1851A。

1.2 方法

1.2.1 造模、分组及处理 采用随数字表法机取10只小鼠作为对照组，另40 只小鼠造模，造模方法参照文献[4]。造模组小鼠予以高反式脂肪酸高果糖饲料（购于美国Research Diets 公司）和复合高糖饮水（购于南通特洛菲饲料科技有限公司）喂饲10 周，自由进食与饮水。高脂饲料热量为5.56 kcal/g，其中58%的能量来源于脂肪；高糖饮水浓度为42 g/L，糖配方为55%果糖∶45%蔗糖。对照组小鼠饲以对照低脂饲料（购于美国Research Diets 公司）16 周，自由进食与饮水。对照饲料热量为4.07 kcal/g，其中11%的能量来源于脂肪。10 周后从造模组随机取4 只小鼠作为造模检测标准，颈椎脱臼法处死小鼠，打开腹腔，取其下腔静脉血液及新鲜肝脏。血清检测提示ALT、AST、TG 水平明显升高，病理检查提示肝脏组织有不同程度的脂肪变性、炎细胞浸润和肝细胞的气球样变，肝细胞因脂肪变性肿胀呈椭圆形或圆形，大量的脂肪空泡充斥于胞质内，肝小叶可见混合的中性粒细胞及单核细胞浸润，提示造模成功。10 周后，36 只造模小鼠随机分为模型组、葛根素高剂量组、葛根素中剂量组、葛根素低剂量组，每组9 只。参照周银吉等[5]方法，葛根素低、中、高剂量组按照0.4、0.6 和0.8 g/（kg·d）剂量分别抽取葛根素母液，使用0.9%氯化钠注射液稀释后，按5 mL/只灌胃；模型组小鼠以0.9%氯化钠溶液灌胃，5 mL/只，共给药6 周，给药期间各组继续给予相应饲料及饮水。

1.2.2 样本获取和处理 16 周末，各组随机取4 只小鼠，禁食12 h 后，用2%戊巴比妥钠按3 mL/kg 剂量腹腔注射麻醉，颈椎脱臼法处死小鼠，打开腹腔，在同一肝叶和位置切取肝脏组织，分装于离心管中，-70°C冰箱保存备用。

1.3 相关蛋白质表达的检测 采用Western blot 法。取各组小鼠肝脏组织，根据BCA 蛋白浓度测定试剂盒方法加入裂解液冰上裂解30 min，4 ℃12 000 r/min 离心5 min，留取上清液，即为提取的总蛋白；检测蛋白浓度并将凝胶中的蛋白质转移至膜上，加入5%脱脂牛奶封闭1～2 h 后洗膜3 次；依次加入稀释后的FAS、SCD-1、PPAR-α、CPT-1、p-IRS1、p-Akt、p-GSK3β、G-6-Pase 和PEPCK 一抗，4 ℃，摇床过夜；加入二抗，37 ℃，2 h，摇床；洗膜5 次；将蛋白化学发光显影，记录、拍照、扫描和保存。以GAPDH 为参照，计算各组小鼠各蛋白灰度值。

1.4 统计学处理 采用SPSS 19.0 统计软件。计量资料组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSDt检验或Dunnett-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠脂肪代谢情况

2.1.1 5 组小鼠FAS、SCD1 蛋白灰度值比较 相比模型组，葛根素低、中和高剂量组FAS、SCD1 蛋白灰度值均极显著降低，差异均有统计学意义（均P＜0.01）；除葛根素低剂量组和中剂量组FAS 蛋白灰度值比较，组间差异无统计学意义（P＞0.05）外，其余各组间比较，差异均有统计学意义（P＜0.01），呈一定的剂量依赖性，见图1。

图1 5 组小鼠FAS 和SCD1 蛋白灰度值比较

2.1.2 5 组小鼠PPAR、CPT-1 蛋白灰度值比较 相比模型组，葛根素各剂量组PPAR、CPT-1 蛋白灰度值均极显著升高，差异均有统计学意义（均P＜0.01）；随葛根素处理浓度升高，葛根素低、中、高剂量组间PPAR、CPT-1 蛋白灰度值均显著升高，差异均有统计学差异（均P＜0.01），见图2。

图2 5 组小鼠PPAR 和CPT-1 蛋白灰度值比较

2.2 小鼠IR 情况

2.2.1 5 组小鼠p-IRS1、p-Akt 及p-GSK3β 蛋白灰度值比较 相比模型组，葛根素低、中、高剂量组p-IRS1、p-Akt 及p-GSK3β 蛋白灰度值均极显著升高，差异均有统计学意义（均P＜0.01）；除低、中剂量组间p-IRS1、p-GSK3β 蛋白灰度值比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）外，其余各组间比较，差异均有统计学意义（均P＜0.01），呈一定的剂量依赖性，见图3。

图3 5 组小鼠p-IRS1、p-Akt 和p-GSK3β 蛋白灰度值比较

2.2.2 5 组小鼠PEPCK、G-6-Pase 蛋白灰度值比较相比模型组，葛根素中、高剂量组PEPCK 和G-6-Pase蛋白灰度值均显著降低，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。随葛根素处理浓度升高，葛根素低、中、高剂量组间PEPCK 和G-6-Pase 蛋白灰度值均显著降低，差异均有统计学差异（均P＜0.01），见图4。

图4 5 组小鼠PEPCK、G-6-Pase 蛋白灰度值比较

3 讨论

研究认为，IR 是NAFL 的重要发病机制。胰岛素可直接抑制脂类分解，当机体处于IR 状态时，胰岛素水解TG 的能力下降，TG 积累，极低密度脂蛋白（very low density lipoprotein，VLDL）合成增加；同时脂蛋白脂肪酶（liportein lipase，LPL）的活性被削弱，导致VLDL降解减少，肝细胞内VLDL 大量蓄积，形成脂肪肝[6]。葛根素是从中药葛根中提取的有效成分，属异黄酮类化合物，具有改善IR、清除氧自由基和抗脂质过氧化的作用，可有效保护肝细胞、抑制肝纤维化[7-9]。研究发现，葛根素具有保肝护肝、降糖降脂、抗炎等药理功能，对治疗和缓解NAFL 有利[10]。

FAS 和SCD-1 是调控脂肪生成的2 个主要限速酶，FAS 能催化乙酰CoA 和丙二酸单酰CoA 合成软脂酸。研究发现肥胖和代谢综合征患者SCD-1 水平上升，抑制SCD-1 的表达则导致线粒体中的脂肪消耗速度加快[11]。本研究中，葛根素各剂量组FAS 蛋白、SCD-1 蛋白灰度值显著降低，提示葛根素抑制了NAFL 小鼠肝细胞内FAS 和SCD-1 的蛋白表达，从而影响脂肪代谢途径。CPT-l 是脂肪酸β 氧化过程中的主要限速酶，CPT-1 被激活后以载体为核心功能参与脂肪酸线粒体β 氧化，可将长链脂肪酸高效通过线粒体内膜，到达线粒体基质，加速脂质代谢，从而降低血清TC 水平[12]。CPT-1 与PPAR-α 组成PPAR-α/CPT-1信号通路[13]。PPAR-α 是游离脂肪酸受体，在脂肪酸β 氧化、能量代谢等过程中发挥关键作用。据报道PPAR-α 通过节肝脏中脂肪酸的摄取和代谢，降低VLDL 与TG 产生，并调节血管内TG 的水解和HDL 的产生，从而实现降血脂的作用[14]。本研究发现低、中、高剂量葛根素可不同程度地激活PPAR-α/CPT-1 表达，促进脂肪酸β 氧化，且以高剂量组增强PPAR-α/CPT-1 表达效果最为显著。提示葛根素可能通过PPAR-α/CPT-1 信号途径促进脂肪氧化分解，调控脂质代谢从而改善肝脏脂代谢。

有研究显示，葛根素能下调NAFL 患者血清瘦素水平，改善患者IR，从而加强胰岛素的作用[15]。p-IRS1、p-Akt 及p-GSK3β 是胰岛素信号通路中的关键蛋白。本研究中，随着葛根素浓度增加，这些蛋白灰度值上升，即蛋白质表达增多。可见葛根素是通过改善小鼠IR 状态对NAFL 小鼠发挥治疗作用的。糖脂代谢主要在人体肝脏内完成，NAFL 患者存在肝脏糖异生增加的现象，体内存在大量内源性葡萄糖。G-6-Pase 和PEPCK 是影响糖异生的限速酶，其含量高低决定了糖异生的速度[16]。干预肝糖异生、减少肝葡萄糖生成，将为改善肝IR 提供广阔前景。本研究发现，葛根素中、高剂量组G-6-Pase 和PEPCK 蛋白灰度值显著低于模型组，说明葛根素可以有效抑制G-6-Pase和PEPCK 的表达。即葛根素通过抑制糖异生达到治疗NAFL 的目的，但具体机制还需进一步验证。

综上所述，葛根素可通过影响糖脂代谢治疗NAFL。