泛素相关基因在肝细胞肝癌中的表达及临床意义

何莉 曹璐璐 廖广霖 杜圣蔚 陈见昂 陈国荣 陈涵斌

原发性肝癌在全球癌症死亡原因中排第3 位，肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是其最常见的组织学类型[1]。泛素-蛋白酶体系统是维持蛋白质稳态的核心，泛素相关基因（ubiquitin-related genes，URGs）的失调与多种疾病相关[2]。已发现以泛素结合酶（ubiquitin binding enzyme，UBE）2C 为代表的URGs 在各种癌症中常异常表达[3-4]，靶向URGs 的抑制剂成为当前研究肿瘤治疗的热点[5-7]。因此探索URGs 在HCC 组织中的表达及意义，对临床诊疗具有重要意义。本研究利用生物信息学、qRT-PCR 技术和免疫组化技术探索并验证HCC 组织中UBE2C 表达及其临床意义，并构建基于URGs 预测HCC 患者预后的临床模型，以期为临床诊疗提供新的方法。

1 材料和方法

1.1 材料 收集2022 年3 月至2022 年6 月温州医科大学附属第一医院手术切除的新鲜HCC 组织22 例及癌旁组织（距离癌边缘至少1 cm）28 例。收集2018 年1 月至2019 年12 月温州医科大学附属第一医院切除的174 例HCC 组织和62 例癌旁组织，利用手动组织芯片仪制作石蜡组织芯片，其中HCC 组织为7 行9 列，每样本3 孔；癌旁组织为4 行8 列，每样本2 孔。所有纳入样本均经过病理诊断，具有完整随访资料，术前未接受放疗或化疗，无自身免疫性疾病或合并其他恶性肿瘤。本研究经本院医学伦理委员会审核通过（批准文号：KY2022-R130），免除患者知情同意。

1.2 生物信息学分析 从癌症基因组图谱（the cancer genome atlas，TCGA）数据库（https:/portal.gdc.cancer.gov/）中获得344 例HCC 患者的RNA 测序转录组数据和临床信息，筛选URGs，并就URGs 的mRNA 表达水平进行排序。以差异表达最明显的UBE2C 为对象，按UBE2C 中位值将转录组数据分为高、低表达两组，分析两组性别、年龄、肿瘤分级、肿瘤-淋巴结-远处转移（tumor-node-metastasis，TNM）分期、T 分期等临床病理特征，并基于UBE2C 表达水平构建HCC 预后模型。

1.3 UBE2C mRNA 相对表达量检测 采用qRT-PCR法。使用Trizol 法提取新鲜HCC 组织和癌旁组织内总RNA，根据TOROIVD®qRT Master Mix 逆转录试剂盒（上海TOROIVD 公司，批号：RTQ-100）方法获得cDNA，根据TOROGreen®HRM qPCR Mix 试剂盒（上海TOROIVD 公司，批号：QET-100）方法对cDNA 产物进行扩增。UBE2C 引物序列：F-5'-GCTTGGGTTGGGACATGAGG-3'，R-5'-CTCGGCAGCATGTGTGTTCA-3'。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物序列：F- 5'GATTCCACCCATGGCAAATTC，R-5'-CTGGAAGATGGTGATGGGATT。使用2-ΔΔCt方法计算各样本中UBE2C mRNA的相对表达量。

1.4 UBE2C 蛋白表达与临床病理特征的关系分析采用免疫组化法鉴别UBE2C 蛋白表达量，采用HE 染色法鉴别UBE2C 蛋白的表达位置。取石蜡组织芯片，脱蜡水化，加3%过氧化氢溶液阻断10 min；抗原修复后加入UBE2C 一抗（美国abcam 公司，批号：ab154022），4 ℃冰箱过夜。加入二抗（美国赛默飞公司，批号：A48275），37 ℃孵育30 min，复温5 min，用PBS 冲洗数次，加入二氨基联苯胺（中国北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：ZLI-9017）显色，清水冲洗，苏木素（中国北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：ZLI-9610）复染50 s。使用光镜观察细胞核染色情况。根据视野中着色细胞数量占细胞总数量评分，＜1%为0 分，1%～25%为1 分，26%～50%为2 分，＞50%为3 分；根据细胞核染色（棕色）强度评分，不着色为0分，弱着色为1 分，中度着色为2 分，强着色为3 分。两项评分相乘得到最后的评分，0～1 分记为阴性（-），2～3分记为弱阳性（+），4～6 分记为阳性（++），7～9 分记为强阳性（+++），其中阴性和弱阳性记为UBE2C 低表达，阳性和强阳性记为UBE2C 高表达。阳性率=（弱阳性+阳性+强阳性）/总标本数×100%。收集患者性别、年龄、肿瘤分化、肿瘤大小、血管侵犯、肝硬化、血清甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）、HBsAg、TNM 分期等临床信息，分析UBE2C蛋白表达与HCC临床病理特征的关系。

1.5 UBE2C 蛋白表达与患者预后的关系分析 根据患者病例或随访记录，收集患者生存状态，末次随访时间为2022 年12 月。绘制Kaplan-Meier 曲线，分析UBE2C 蛋白表达情况与患者预后的关系。

1.6 UBE2C 的基因文库富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA） 使用GSEA 软件（http://software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp）在线分析UBE2C 高表达组的基因富集通路。

1.7 基于UGRs 的预后模型构建 利用MSigDB 数据库“REACTOME”蛋白“UBIQUITINATION”基因集中提取URGs；登录TCGA 数据库下载HCC 患者转录组矩阵中这些基因的表达情况，绘制成新的矩阵，筛选出其中差异表达的URGs。采用多因素Cox 回归分析找出其中对HCC 患者生存结局有影响的URGs。为防止数据过度拟合，再次进行Lasso 回归分析，最终找出与HCC 预后相关的关键URGs，构建基于URGs 的预后模型。根据风险评分的中位值分为高风险组和低风险组，比较两组预后。采用时间依赖ROC 曲线分别计算1、2、3 年生存期该模型曲线的AUC。

1.8 统计学处理 使用GraphPad Prism 8.0 统计软件。计量资料组间比较采用两独立样本t检验。UBE2C 蛋白表达情况与HCC 临床病理特征的关系分析采用χ2检验。采用单因素Cox 回归分析UBE2C 及临床病理特征与HCC 预后的关系，并将得到的有统计学意义的数据纳入多因素Cox回归分析，预测HCC预后的独立危险指标。绘制Kaplan-Meier 曲线，分析URGs、UBE2C与临床预后的关系，分析高风险组和低风险组预后。P＜0.05为有差异有统计学意义。

2 结果

2.1 UBE2C mRNA 表达及与临床病理特征的关系 生物信息学分析和qRT-PCR 结果均显示，与癌旁组织相比，UBE2C mRNA 在HCC 组织中高表达（P＜0.05），见图1。高表达的UBE2C 与肿瘤分级、T分期、TNM 分期均有关（均P＜0.01），但与患者性别无关（P＞0.05），见表1；多因素Cox 回归分析结果显示，UBE2C 是影响HCC 患者总生存期的独立危险因素（P＜0.01），见表2。

表1 基于癌症基因组图谱的HCC患者UEB2C表达与临床病理特征的关系[例（%）]

表2 基于癌症基因组图谱的HCC多因素风险分析

图1 UBE2C mRNA 在HCC 组织与癌旁组织中表达的比较（A：癌症基因组图谱转录组数据，B：qRT-PCR数据）

2.2 UBE2C 蛋白表达及与临床病理特征的关系 免疫组化结果显示，UBE2C 蛋白在HCC 组织中的阳性表达率显著高于癌旁组织（P＜0.01），见表3；HCC 组织中可见细胞核染色明显，提示UBE2C 表达主要位于细胞核，而癌旁组织中未见，见图2（插页）。高表达的UBE2C 与肿瘤分化程度、TNM 分期、血清AFP 和HBsAg 有关（均P＜0.05），与肿瘤大小、血管侵犯、肝硬化、患者性别和年龄无关（均P＞0.05），见表4。

表3 不同组织中UBE2C的免疫组化染色结果（例）

表4 基于组织芯片的HCC患者UBE2C蛋白表达与临床病理特征的关系[例（%）]

图2 不同组织中UBE2C 染色结果（A：HCC 组织；B：HCC 组织中的UBE2C 表达；C：癌旁组织；D：癌旁组织中的UBE2C 表达）

2.3 HCC 患者UBE2C 表达与预后的关系 基于TCGA的Kaplan-Meier曲线分析发现，UBE2C mRNA高表达组HCC 患者累积生存率低于低表达组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3A。174例患者随访时间为2～67个月，中位随访时间为47 个月。生存分析结果显示，UBE2C 蛋白高表达组HCC 患者累积生存率低于低表达组，差异有统计学意义（P＜0.01），见图3B。

2.4 UBE2C 的基因富集通路 将TCGA 数据库中筛选出的UBE2C 的基因文库使用GSEA 软件在线从京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）中分析UBE2C 高表达组的基因富集通路，上调的UBE2C 基因主要富集在碱基切除修复、细胞周期、DNA 复制、同源重组、核苷酸切除修复、p53 信号通路、嘌呤代谢、嘧啶代谢、剪接体、泛素介导的蛋白降解途径等10 条通路，见图4（插页）。

图4 UBE2C 的基因富集图（显示前10 位富集通路）

2.5 基于URGs 的HCC 临床预后模型 MSigDB 数据库中共提取出79 个URGs，其中UBE2C、DNA 依赖性蛋白激酶（protein kinase DNA-activated catalytic polypeptide，PRKDC）、含WW 域衔接因子卷曲螺旋（WW domain containing adaptor with coiled-coil，WAC）、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、UBE2L3、UBE2S、UBE2E1、环指蛋白20（ring finger protein 20，RFP20）、UBE2J2、UBE2D2、泛素结合酶B（ubiquitin-conjugating enzyme B，UBB）等11 个URGs 均与HCC 预后紧密相关。用该组基因建立临床预后模型，高风险患者总生存率低于低风险组（P＜0.05），见图5A；该模型预测HCC 患者术后1、2、3 年生存期的AUC 分别为0.762、0.708、0.683，见图5B。

图5 基于URGs 的HCC 临床预后模型（A：两组患者的生存曲线；B：预后模型的时间依赖ROC 曲线）

3 讨论

目前HCC 中新型生物标志物研究多处于临床前的研发与验证中[8]。URGs 是人体蛋白质稳态的核心[9]，还参与DNA 损伤和修复、细胞凋亡和存活、细胞分化以及耐药性相关因子的调控[10]。有研究发现HCC组织中存在URGs 表达失调[11]。因此，探索HCC 中URGs 的表达及临床意义具有重要价值。

URGs 包括泛素、泛素激活酶、泛素结合酶、泛素连接酶、去泛素化酶以及26S 蛋白酶体。UBE2C 是泛素结合酶基因中的一员，目前已发现在乳腺癌、胃癌等多种恶性肿瘤中高表达，且与肿瘤不良预后相关[11-12]。在头颈部鳞癌中，UBE2C 可通过抑制放疗导致的细胞凋亡来促进肿瘤的进展[13]。此外，有研究发现卵巢癌和肺癌中UBE2C 的过表达诱导了顺铂的耐药性[14-15]。Xiong 等[16]也发现沉默UBE2C 增加了HCC细胞对索拉非尼的敏感性，而索拉非尼是晚期肝癌患者的一线化疗药物。因此，推测UBE2C 可能是HCC 预后的生物学标志，靶向UBE2C 的治疗可能成为HCC 治疗的新策略。

本研究发现UBE2C 是HCC 中差异表达最高的URGs，数据库信息转录组信息、石蜡组织蛋白表达检测、新鲜组织mRNA 含量检测均证明UBE2C 在肝癌中过表达。UBE2C 表达与肿瘤分级、TNM 分期有关，分级或分期越高，UBE2C 的表达越高，这种表达特征同样在乳腺癌、胃癌、宫颈癌中被发现[17-19]。UBE2C 过表达时，细胞往往呈现出生长速度提升、密度增加，表明UBE2C 有促进细胞生长和恶性转化的能力[20]。UBE2C高表达预示着较差预后，进一步证实了UBE2C 与肿瘤恶性程度相关。

本研究还发现UBE2C 高表达还与T 分期（肿瘤大小）及患者年龄相关，与以往研究结果一致[21-22]。然而，UBE2C 的表达在Ⅲ级与Ⅳ级、Ⅳ期与前3 期间比较，差异无统计学意义，这可能与Ⅳ级和Ⅳ期患者信息过少导致数据存在偏倚、Ⅳ级和Ⅳ期患者中往往包括一些分化差的病例导致原有的生物标志丢失等因素有关。有研究表明，编码蛋白质合成的相关基因随年龄增加表达水平整体呈下降趋势，而下降的原因仍在进一步探讨之中[23]。因此高年龄组患者中UBE2C的表达下降可能与衰老引起的蛋白质合成功能减弱相关。本研究发现UBE2C 是影响HCC 患者总生存期的独立风险因素；结合免疫组化结果可知，UBE2C 高表达不仅与肿瘤分级、TNM 分期有关，还与血清中AFP、HBsAg 相关。Wang 等[12]将368 例肝癌患者根据转录组数据分为AFP 高表达组和AFP 低表达组，结果发现AFP 高表达组UBE2C 呈高表达（P＜0.01），说明UBE2C 的表达与AFP 表达存在正相关。目前暂未有研究证实UBE2C 表达水平与HBsAg 的直接相关性，但Chen 等[22]对1 344 例无HBV 感染者、1 560 例HBV 携带者和1 057 例HBV 相关HCC 患者的对照研究发现，UBE2L3 不仅是HBV 感染的易感基因，还是HBV 相关HCC 的易感基因。UBE2L3 与UBE2C 同属E2s 家族[23]，在本研究中两者共同参与构成HCC 泛素化相关预后模型。这些证据表明UBE2C 是HCC 不良预后的生物标志。

本研究用筛选得到的11 个URGs（UBE2C、PRKDC、WAC、PCNA、UBE2L3、UBE2S、UBE2E1、RNF20、UBE2J2、UBE2D2、UBB）来构建HCC 预后模型，该模型预测HCC 患者1、2、3 年生存期的AUC 值分别为0.762、0.708、0.683；依此将患者分为高风险组和低风险组，结果发现高风险患者总生存率低于低风险组。表明此组基因在HCC 中具有预测不良预后的能力，尤其是短期预测意义最为精确。可见URGs 在HCC 的发展中存在重要作用，靶向URGs 的研究在HCC 中可能成为新的方向。