补气益精生血中药对人红系细胞组蛋白修饰酶的影响

陈珏璇, 徐方蔚, 卢焯明

地中海贫血在我国南方及多个热带亚热带国家高发,严重危害儿童健康[1-2]。目前的婚检产检手段对于家族史不详的轻型地中海贫血未必能做出准确的筛查,如父母均为轻型地中海贫血,即有可能生出中间型或重型地中海贫血患儿。这部分患儿常常需要规律输血及除铁,这些均为治标手段,且存在较多不良反应,对于我国及发展中国家的患者和政府公共卫生支出也是巨大的负担[2-3]。目前我国每年仍有相当数量的地中海贫血患儿不断降生,而现存的很多地中海贫血患儿也尚未能得到很有效的治疗,这既是当今医学的难题,也成为重要的社会问题。

对于β珠蛋白基因缺陷的β地中海贫血而言,诱导γ珠蛋白表达以代偿β珠蛋白功能是其重要的新型治疗手段,但目前各种诱导西药均有免疫抑制等明显副作用[4-5]。我们既往发现健脾补气生血的中药黄芪、党参及补肾益精生血的中药龟板等可激活人类红系细胞株γ珠蛋白基因的表达[6]。随后的临床研究显示上述中药组成的补气益精生血方药对儿童β地中海贫血有良好疗效且副作用小,能有效诱导患儿γ珠蛋白基因的表达、合成胎儿血红蛋白而发挥代偿正常血红蛋白的作用[7-9],其诱导机制与激活p38丝裂原活化的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)信号通路[8-9]等有关。我们的前期体外研究还提示中药可通过p38MAPK通路增强γ珠蛋白基因启动子区组蛋白磷酸化乙酰化修饰,使相关区域染色质结构松散而基因易于转录[10]。至于中药是否通过影响组蛋白酶从而提高修饰水平,目前尚未明了。本研究在既往基础上继续深入,观察本课题中药能否影响人红系细胞组蛋白修饰酶相关指标,包括组蛋白脱乙酰基酶(histone deacetylase,HDAC)中的HDAC1、HDAC2,组蛋白乙酰基转移酶(histone acetyltransferase,HAT),以期进一步从表观遗传角度揭示中药治疗地中海贫血的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 目前永生化的人红系细胞K562为研究珠蛋白基因表达及胎儿血红蛋白诱导的常用工具,本研究选用K562细胞株作为研究对象,由广州致邦生物科技有限公司提供[赛库生物(CellCook),货号CC1901]。

1.1.2 药物 黄芪、龟板、党参1∶1∶1水提物(补气益精生血中药),黄芪、党参1∶1水提物(补气生血中药)以及龟板水提物(益精生血中药)分别按2.5 g/L及10 g/L的浓度委托广州中医药大学中西医结合基础研究中心以水提法进行制备。丁酸钠(Sigma公司)。

1.1.3 试剂 Trizol试剂(Thermo Fisher公司);胎牛血清、RPMI中性1640培养基(GIBCO公司);PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser逆转录试剂盒、TB Green Premix Ex Taq Ⅱ荧光定量PCR试剂盒(TaKaRa公司);EpiQuikTMm6A RNA Methylation Quantification Kit试剂盒(EPIGENTEK公司);RIPA裂解液、聚丙烯酰胺凝胶(碧云天公司);二喹啉甲酸蛋白定量试剂盒(美仑生物公司);IgG二抗、HDAC1一抗,HDAC2一抗、HAT一抗(Abcam公司);超敏化学发光试剂盒(Millipore公司)。

1.1.4 仪器 匀浆机(IKA公司);-80 ℃冰箱(NBS公司);高速低温离心机(科大创新公司);微量移液器(GILSON公司);全自动实时荧光定量PCR仪(BIO-RAD公司);酶标仪(PerkinElmer公司);蛋白电泳仪(BIO-RAD公司);显影仪成像分析系统(UVP公司)。

1.2 研究方法

1.2.1 分组及加药 K562细胞株取8等份,根据我们前期浓度梯度及时间梯度预实验得出的高、低诱导浓度与最佳诱导时间,按以下8组分别加药:(1)以2.5 g/L黄芪、龟板、党参1∶1∶1水提物诱导96 h的为补气益精低剂量组;(2)以10 g/L黄芪、龟板、党参1∶1∶1水提物诱导96 h的为补气益精高剂量组;(3)以2.5 g/L黄芪、党参1∶1水提物诱导96 h的为补气低剂量组;(4)以10 g/L黄芪、党参1∶1水提物诱导96 h的为补气高剂量组;(5)以2.5 g/L龟板水提物诱导96 h的为益精低剂量组;(6)以10 g/L龟板水提物诱导96 h的为益精高剂量组;(7)以500 μmol/L丁酸钠诱导72 h的为阳性对照组(丁酸钠组);(8)未加药处理的为空白对照组。

1.2.2 γ珠蛋白基因表达水平检测 诱导结束后收集各组细胞。从Genbank查得γ珠蛋白基因序列,设计引物如下:Forward:5′-GGC AAC CTG TCC TCT GCC TC-3′,Reverse:5′-GAA ATG GAT TGC CAA AAC GG-3′。以Trizol裂解K562细胞,加氯仿抽提总RNA,利用PrimeScript RT逆转录酶逆转录合成cDNA,以cDNA为模板,实时PCR扩增γ基因核酸。采用TB Green作为荧光素分子标志,实时读取荧光强度并自动描出各样本扩增曲线。根据Ct值、标准曲线以及以内参基因GAPDH核酸量矫正,算出每个样本γ基因的核酸拷贝数。实验重复3次。

1.2.3 HDAC1、HDAC2、HAT活性检测 提取细胞总RNA。制备缓冲液、抗体溶液、增强剂溶液及阳性对照品,制备标准曲线。按照说明书添加稀释液体、培养及进行酶反应。反应终止后在450 nm处读取吸光度。用专门公式计算m6A在总RNA中的含量。

1.2.4 HDAC1、HDAC2、HAT基因mRNA水平检测 HDAC1引物如下:Forward:5′-CGC TCC ATC CGT CCA GAT AAC ATG-3′,Reverse:5′-GCC ACA GAA CCA CCA GTA GAC AAC-3′。HDAC2引物如下:Forward:5′-CGA GCA TCA GAC AAG CGG ATA GC-3′,Reverse:5′-AGC CAC ATT TCT TCG ACC TCC TTC-3′。HAT引物如下:Forward:5′-GTC TGG AAT GCT GTG TGC TGG AG-3′,Reverse:5′-GCC GCC GTG AGT CTT CTT GTA C-3′。其余方法同1.2.2。

1.2.5 HDAC1、HDAC2、HAT蛋白水平检测 裂解K562细胞,提取总蛋白,二喹啉甲酸蛋白浓度测定,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白,转聚偏二氟乙烯膜。封闭洗涤后,分别以HDAC1、HDAC2、HAT的一抗、二抗先后与蛋白孵育杂交,以GAPDH蛋白为内参照,使用超敏化学发光试剂盒曝光显影,通过显影仪分析系统分析每个样本目的蛋白条带与内参照条带的积分光密度值(integrated optical density,IOD)比值。

2 结果

2.1 γ珠蛋白基因mRNA水平 经内参基因核酸量矫正的γ珠蛋白基因mRNA的相对拷贝数见表1。单因素方差分析结果显示,各组间差异有统计学意义(P<0.001)。其中补气益精高剂量组、补气高剂量组、益精低剂量组及丁酸钠组的γ珠蛋白基因mRNA水平均显著高于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 各组γ珠蛋白基因mRNA水平

2.2 HDAC1、HDAC2、HAT酶活性水平 各组K562细胞经酶标仪比色法测定的HDAC1、HDAC2、HAT酶活性水平见表2。单因素方差分析结果显示,各组差异有统计学意义(P<0.001)。各中药组的HAT酶活性水平均高于空白对照组,其中,补气益精高、低剂量组及益精高、低剂量组与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。丁酸钠组HDAC1酶活性水平显著低于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 各组HDAC1、HDAC2、HAT酶活性水平

2.3HDAC1、HDAC2、HAT基因mRNA水平 经内参基因核酸量矫正的γ珠蛋白基因mRNA的相对拷贝数见表3。单因素方差分析结果显示,HAT基因组间比较差异有统计学意义(P<0.001),其中补气益精高、低剂量组,益精高剂量组以及丁酸钠组均显著高于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。

表3 HDAC1、HDAC2、HAT基因mRNA水平

2.4 HDAC1、HDAC2、HAT蛋白水平 各组HDAC1、HDAC2的Western Blot蛋白条带经内参照蛋白矫正的IOD比值比较差异无统计学意义(P>0.05)。HAT蛋白组间比较差异有统计学意义(P<0.001),其中补气益精高剂量组和益精高剂量组显著高于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。HAT蛋白及内参蛋白条带见图1。

图1 各组Western Blot蛋白条带图像

3 讨论

γ珠蛋白基因诱导是β地中海贫血治疗手段的研究热点之一[4-5]。即通过药物或手段诱导γ胎儿珠蛋白基因在儿童期重新高表达,γ珠蛋白链与过剩的α链结合生成胎儿血红蛋白(α2γ2),一方面可在功能上弥补由于β珠蛋白合成障碍所导致的正常成人血红蛋白的减少,另一方面结合过剩的α链可纠正珠蛋白链的不平衡,减少α四聚体对红细胞的损伤,减轻溶血及无效造血,从而改善贫血,减少并发症。现存为数不多的诱导西药均存在各种副作用,比如抑制免疫或抑制骨髓,或者价格昂贵、药效短暂等,可用于临床的还不多。近年我们把研究的目光转到了副作用较小的传统中医中药。

我们前期对儿童β地中海贫血的中医证候规律研究显示,儿童β地中海贫血的主要证候是脾虚气血不足及肝肾阴精亏虚[11-12],继而我们拟定了健脾补气生血和补肾益精生血结合,即补气益精生血的核心治法,并结合课题组的系列体外实验结果[6,13-14],制定了以黄芪、党参、龟板组成的补气益精生血复方进行了多项临床研究。结果表明补气益精生血治法方药能有效提升β地中海贫血患儿的总血红蛋白及胎儿血红蛋白水平,改善红细胞、平均血红蛋白含量等血液学指标及中医证候,也未发现有抑制骨髓抑制或影响肝肾功能等副作用[7-9,15-16]。其起效机制与诱导γ珠蛋白基因表达合成胎儿血红蛋白、激活p38MAPK信号通路以及调节相关红系转录因子等有关[8-9,16]。至于其下游对珠蛋白基因的表观遗传调控,课题组研究显示单味龟板以及黄芪多糖均可通过p38MAPK信号通路提高γ珠蛋白基因启动子区组蛋白修饰水平[10],而启动子区组蛋白修饰水平高则基因更容易表达,达到诱导γ珠蛋白基因表达的目的。但中药是否通过影响组蛋白修饰的相关催化酶从而增强组蛋白修饰,目前还未明确。

本实验结果显示,无论是中药还是阳性对照药丁酸钠,各用药组的γ珠蛋白基因mRNA水平均高于空白对照组,再次验证了本课题中药可诱导γ珠蛋白基因的表达。其中补气益精高剂量组和益精低剂量组诱导效果明显优于丁酸钠,而有部分中药组与空白对照组差异无统计学意义,可能与样本量较小及组内变异较大有关。

组蛋白的乙酰化磷酸化等活性修饰可令染色质结构松散,产生开放功能域,有利于基因转录。HDAC1、HDAC2可抑制组蛋白的乙酰化,而HAT则会增强组蛋白的乙酰化。人类在新生儿期后HDAC逐渐使γ珠蛋白基因启动子区域的组蛋白去乙酰化,染色质结构致密,故γ珠蛋白基因不再表达,而使用丁酸钠等HDAC抑制剂则可恢复组蛋白乙酰化,从而促进γ珠蛋白基因的表达[17-18]。我们原本猜想中药可能与丁酸钠有类似抑制HDAC的效果,但实际实验结果显示中药却是提升了HAT的酶活性。我们进一步观察了人红系细胞内各乙酰化修饰酶基因的mRNA水平及蛋白水平,发现多组中药对HAT的mRNA转录表达均有显著性上调作用。而最终翻译后的蛋白水平,只有补气益精高剂量组及益精高剂量组可显著提升HAT蛋白表达。尤其是补气益精高剂量组,在HAT的酶活性、mRNA水平及蛋白水平三项指标上均有一致显著性的提升。这提示我们补气益精生血的中药可能通过上调HAT的表达进而促进红系细胞内γ珠蛋白基因启动子区组蛋白的乙酰化修饰,从而诱导γ珠蛋白基因的进一步表达。

p38MAPK通路是外源信号从细胞表面传导到核内染色质的重要传递者,它介导胞内蛋白激酶的级联反应,影响核内基因转录,活化的p38MAPK可发生转位进入核内,将修饰信号逐级传递至γ珠蛋白基因启动子区域的组蛋白或相关转录因子,促进红系分化及诱导基因表达[19-20]。目前除我们课题组外,中药对人红系细胞p38MAPK-组蛋白修饰路径影响的研究鲜见报道,下一步实验可设立以p38MAPK特异抑制预处理的对照组,再观察中药对组蛋白修饰酶的影响,验证HAT水平的提升及乙酰化的增强确实依赖于上游的p38MAPK的活化。我们的系列研究从表观遗传角度揭示中医药治疗β地中海贫血的分子机制,为开发地中海贫血的国家中药新药提供实验依据,课题对于我国地中海贫血高发区具有较大的实用价值、广泛的应用前景及重要的社会意义,对研究人类发育阶段特异性的珠蛋白表达转换及人类表观遗传调控也将提供一定科学参考价值。