鱼腥草素钠对脂多糖诱导单核巨噬细胞RAW264.7炎性反应的抑制作用*

胡学洋，黄 鹏，吴陈亮

（1. 安徽中医药大学药学院，安徽合肥 230012； 2. 江苏省南通市海门长三角药物高等研究院，江苏南通226133； 3. 上海欧米尼医药科技有限公司，上海 201203）

巨噬细胞是机体内重要的炎性细胞，其通过参与炎性反应的启动，分泌大量的炎性介质和炎性因子，促炎因子的过量表达会进一步增强和放大炎性反应，在炎性疾病的发生发展过程中发挥重要作用［1-2］。鱼腥草为三白草科植物蕺菜的干燥地上部分，在我国南方多有种植，《中国药典》记载其有清热解毒、消痈排脓、利尿通淋的作用［3］。成分中以鱼腥草挥发油的药用活性价值较高［4］，其有效成分主要为鱼腥草素，但结构不稳定。目前使用的主要是鱼腥草素和亚硫酸氢钠的加合物鱼腥草素钠（SH），该化合物保留了鱼腥草素的主要药理活性，且比鱼腥草素更稳定［5-6］。SH（分子式为C12H23NaO5S）为白色的针状结晶性粉末，在水或乙醇中微溶，在氯仿或苯中几乎不溶。SH 有抗炎［7］、抗菌［8］、止咳平喘［9］、抗过敏［9］、抗肿瘤［10］作用，但其对脂多糖（LPS）诱导小鼠单核巨噬细胞RAW264.7 的作用及机制尚不明确。因此，本研究中采用LPS 诱导RAW264.7细胞以复制体外炎症模型，探讨SH 抑制炎性反应的作用机制，为SH 的应用与开发提供理论依据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

仪器：BL310/BL21S 型分析天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司，精度为0.01 mg）；HF100 型CO2培养箱（上海力申科学仪器有限公司）；CMax Plus 型酶标仪（美国Molecular Devices 公司）；HR/ T16MM 型高速冷冻离心机（湖南赫西仪器装备有限公司）；PowerPac 型电泳仪/转膜仪（美国Bio-Rad 公司）；Focus 化学发光凝胶成像仪（杭州申花科技有限公司）。

试药：SH（湖北诺纳科技有限公司，批号为2022082502）；LPS（美国Sigma 公司，批号为L2630）；DMEM 高糖培养基（江苏凯基生物技术股份有限公司，批号为KGM12800 - 500）；噻唑蓝（MTT，美国Sigma 公司，批号为M2003）；一氧化氮（NO）检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号为S0023）；前列腺素E2（PGE2）检测试剂盒（江苏晶美生物科技有限公司，批号为JM-02345M2）；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）检测试剂盒（批号为RK00027），白细胞介素6（IL - 6）检测试剂盒（批号为RK00008），均购自武汉爱博泰克公司；诱导型一氧化氮合酶（iNOS）抗体、Rabbit β -Actin（武汉博士德生物工程有限公司，批号分别为BA0362，81115-1-RR）；核因子-κB（NF-κB）P65 抗体（美国proteintech 公司，批号为10745 - 1 - AP）；NF - κB - P - P65抗体、P - IκB - α 抗体（美国Zen - Bio 公司，批号分别为310052，R24671）；环氧合酶2（COX - 2）抗体（美国Abcan 公司，批号为ab32510）；BCA 蛋白浓度检测试剂盒（美国Perhor公司，批号为PH70013）；胎牛血清（美国Excell Bio公司，批号为12J079）。

细胞系：小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7（南京普皓生物技术有限公司，批号为778194）。

1.2 方法

细胞培养：取RAW264.7 细胞，加入含10%胎牛血清的DEME 高糖培养基，在37 ℃、5%CO2培养箱中培养。每2～4天传代1次。

NO水平：取对数生长期RAW264.7细胞，调整密度为1×106个/mL，以每孔2 mL 加入6 孔板中，置37 ℃、5%CO2培养箱中培养。实验分为空白对照组（等体积培养基）、模型组（等体积培养基）及SH 低、中、高剂量组（1.25，5，10 μmol/L）。以含不同浓度SH 的常规培养基培养细胞2 h，加入LPS置37 ℃、5%CO2培养箱继续培养24 h。使用酶标仪测定540 nm 波长的吸光度（A）值并计算NO含量。

TNF - α，IL - 6，PGE2水平：取对数生长期RAW 264.7 细胞，同法分组、给药、培养。采用酶链免疫吸附法检测TNF-α，IL-6，PGE2水平。

iNOS、COX-2及NF-κB通路相关蛋白表达水平：取对数生长期RAW264.7 细胞，同法分组、给药、培养，提取细胞总蛋白，用BCA 试剂盒对样品蛋白进行定量。采用Western blot 法检测iNOS，COX - 2，β - actin 及NF - κB P65，NF - κB - P - P65，P - IκB - α，β - actin蛋白的表达水平。

1.3 统计学处理

采用Graphpad Prism 9 统计学软件分析。组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NO 水平

与空白对照组比较，模型组细胞NO 水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，SH 中、高剂量组细胞NO 水平显著降低（P＜0.01）。详见图1。

注：①- ⑤分别为空白对照组、模型组及SH 低、中、高剂量组。与①组比较，#P ＜ 0.01；与②组比较，*P ＜ 0.01。图2 至图4同。图1 细胞NO水平（±s，n=3）Note：①-⑤refers to blank control group，model group，SH low-，medium - and high - dose groups，respectively. Compared with those in the ①，#P ＜0.01；compared with those in the ②，*P ＜ 0.01（for Fig.1-4）.Fig.1 NO level in cells（±s，n=3）

2.2 细胞TNF-α，IL-6，PGE2 水平

与空白对照组比较，模型组细胞TNF-α、IL-6 及PGE2水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，SH 低、中、高剂量组细胞TNF - α，IL - 6，PGE2表达水平均显著降低（P＜0.01）。详见图2。

图2 细胞TNF-α，IL-6，PGE2水平（±s，n=3）A.TNF-α B.IL-6 C.PGE2Fig.2 TNF-α，IL-6 and PGE2 levels in cells（±s，n=3）A.TNF-α B.IL-6 C.PGE2

2.3 细胞iNOS 和COX-2 蛋白表达水平

与空白对照组比较，模型组细胞iNOS、COX - 2 蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，SH中、高剂量组细胞iNOS蛋白表达水平显著降低（P＜0.01），SH 低、中、高剂量组细胞COX-2 蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）。详见图3。

A. 电泳图 B.iNOS数据统计 C.COX-2数据统计图3 细胞iNOS和COX-2蛋白表达水平（±s，n=3）A.Electropherogram of protein expression B.Data statistics of iNOS expression C.Data statistics of COX-2 expressionFig.3 Expression levels of iNOS and COX-2 proteins in cells（±s，n=3）

2.4 细胞NF-κB 信号通路相关蛋白表达水平

与空白对照组比较，模型组细胞NF - κB - P -P65、P-IκB-α 蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，SH 低、中、高剂量组细胞NF - κB - P -P65和P-IκB-α蛋白表达水平均显著降低（P＜0.01）。详见图4。

A. 电泳图 B.NF-κB-P-P65数据统计 C.P-IκB-α数据统计图4 细胞NF-κB信号通路蛋白表达水平（±s，n=3）A.Electropherogram of protein expression B.Data statistics of NF-κB-P-P65 expression B.Data statistics of P-IκB-α expressionFig.4 Expression levels of NF-κB signaling pathway proteins in cells（±s，n=3）

3 讨论

预试验中采用MTT 法，检测了SH 对细胞活性的影响，结果SH浓度在0～20 μmol/L之间对RAW264.7细胞增殖无明显抑制作用，故本研究中选择SH 浓度为1.25，5，10 μmol/L 开展后续实验。在炎症发生发展过程中，巨噬细胞会产生过量的PGE2，NO，TNF-α，IL-6等炎性介质，继而引发一系列炎性反应。NO 为重要的炎性介质，过量NO 能损伤DNA，抑制线粒体中的呼吸作用，进而促进炎性反应发生［11-12］。PGE2为重要促炎因子，其与受体结合后可加速炎性反应［13］。促炎因子TNF-α是早期炎症的标志物，能介导炎症、免疫反应及组织损伤，多种炎症相关疾病均呈现高水平TNF-α［14］。IL- 6 为免疫调节因子，与TNF- α 共同参与调节炎性反应，为反映机体炎症程度的重要指标［14］。本研究中，SH 可显著抑制LPS 诱导的RAW264.7 细胞NO，PGE2，TNF-α，IL-6 的分泌，说明其抗炎作用与抑制炎性因子和炎性介质的分泌有密切联系。

iNOS 酶是NO 合成酶，它的表达直接决定NO 释放量［15］。COX - 2 酶可催化花生四烯酸生成前列腺素前体，在正常细胞中几乎不表达，当受到外源刺激后表达水平会迅速升高，是反映炎症严重程度的重要标志酶［16］。本研究中，RAW264.7 细胞经LPS 刺激后，iNOS和COX - 2 蛋白表达水平显著升高，SH 能显著降低iNOS和COX-2蛋白的表达水平，该结果与细胞上清液中测定的NO 和PGE2水平变化相一致，说明SH 可通过抑制iNOS和COX-2蛋白的表达抑制炎性因子分泌。

NF - κB 通路作为经典的炎症通路，在正常情况下，IκB - α 与NF - κB 以无活性复合物的形式存在于细胞质中。当细胞受到LPS 刺激时，IκB-α 会迅速磷酸化降解，NF - κB 亚单位从细胞质转移到细胞核内，启动炎性细胞因子转录，诱发炎症［16-18］。本研究中，RAW264.7 细胞经LPS 刺激后，细胞中P-IκB-α 蛋白的表达水平显著升高，但经SH处理后，P-IκB-α蛋白表达水平的降低呈剂量依赖性，可能的机制是IκB-α与P65 二聚体在细胞质内水解，使NF-κB 亚单位解离出来，然后转入细胞核，调控基因表达，产生有关炎性因子和介质，而SH 进入细胞后可能抑制了IκB - α 与P65 二聚体在细胞质内水解，蛋白磷酸化水平显著下降，从而抑制了NF - κB 信号通路的表达，进而抑制炎症的发生与发展。

综上所述，SH可抑制细胞炎性因子的分泌，其机制与抑制炎性蛋白iNOS和COX-2的表达及调控NF-κB通路有关。