基于Olsen法测定土壤速效磷的操作改进

吉力力·麦麦提,程芮琪,杨兰芳,李亚东,云月利,倪红,孙敬国,孙光伟,李建平,冯吉,陈振国

(1.湖北大学资源环境学院,湖北 武汉 430062;2.湖北大学生命科学学院,湖北 武汉 430062;3.湖北省烟草科学研究院,湖北 武汉 430030)

磷是植物营养三要素之一,严重影响植物生长代谢[1-2].土壤供磷不足降低植物产量和品质,导致经济损失,磷肥施用过量,又会造成农业面源污染,导致水体富营养化等生态环境问题[3-4].土壤速效磷反映了土壤磷的供应水平,是土壤质量评价的重要指标,也是土壤管理、合理施用磷肥和改善植物磷素营养的重要依据.因此在土壤资源利用和评价中一般都需要测定土壤速效磷的含量.土壤速效磷的测定多采用Olsen法[5],即用 0.5 mol L-1的碳酸氢钠(pH8.5)提取,钼锑抗试剂显色分光光度法测定,所以一般把土壤速效磷称为Olsen磷[4].测定的基本原理是石灰性、中性和酸性土壤中速效磷可以被碳酸氢钠的碱性溶液提取到溶液中来,在一定酸度和三价锑存在下,磷与钼酸铵反应生成锑磷钼杂多酸,可以被还原剂抗坏血酸还原为磷钼蓝,溶液蓝色的深浅与磷的浓度在一定范围内符合郎伯比尔定律,利用标准曲线法定量.用碳酸盐的碱溶液作浸提剂,由于碳酸根的同离子效应而降低土壤中碳酸钙的溶解度,从而有利于土壤磷酸钙盐中磷的提取,同时溶液呈碱性也降低了土壤铁、铝离子的活性,有利于土壤磷酸铁铝中磷的提取,加上碳酸氢钠碱性溶液中存在OH-、HCO3-、CO32-等阴离子的存在,有利于吸附态磷的置换,因此本法不仅适用于石灰性土壤,也适用于中性和酸性土壤速效磷的提取[6],是当前运用非常广泛的土壤速效磷测定方法.但在分析实践中,发现常规操作中存在一些问题,如加显色剂后摇动时剧烈冒泡导致液体溢出、驱赶气泡消耗时间使显色不在最佳环境中反应、用容量瓶或比色管定容时也会因溢出气泡损失液体、比色时因瓶颈效应不好控制倒入比色皿中液体的量等,造成反应体系不够稳定,重现性不好,对于有机质含量高的土壤需用活性炭处理,而活性炭的制备非常繁琐.为了快速准确测定土壤速效磷,本研究在Olsen法基础上进行了试剂配制、显色容器、样品和试剂用量等方面的改进,不仅简化了操作,而且使反应体系更加稳定,结果重现性更好,准确度和精确度增加,试剂用量减少,分析成本降低,具有很强的实际应用价值.

1 材料与方法

1.1 方法1：环保标准HJ 704—2014的操作[7]

1.1.1 试剂配制

1)氢氧化钠溶液(NaOH,10%)：称10 g氢氧化钠溶于水,冷却后稀释至100 mL,贮于聚乙烯瓶中.

2)浸提剂：0.5 mol L-1NaHCO3,称取42.0 g碳酸氢钠溶于约800 mL水中,加水稀释至约990 mL,用10%的氢氧化钠在pH计上调节至pH8.5,加水定容至1 000 mL.贮于聚乙烯瓶中,应在4 h内使用.

3)酒石酸锑钾溶液(K(SbO)C4H4O6·1/2H2O,5 g L-1)：称取5 g酒石酸锑钾溶于100 mL水中.

4)钼锑储备液：将153 mL浓硫酸缓缓贮于盛有400 mL水的大烧杯中,搅拌冷却.另称取10.0 g钼酸铵于盛有300 mL 60 ℃水的大烧杯中,并使之溶解,放冷.然后将上述硫酸溶液倒入此钼酸铵溶液中,搅匀后再加入100 mL酒石酸锑钾溶液.最后转移至1 000 mL容量瓶中加水定容,摇匀保存于棕色瓶中.

5)抗坏血酸溶液：称取10 g抗坏血酸溶于水中,加入0.2 g EDTA二钠和8 mL冰醋酸,加水定容至100 mL,贮于棕色瓶中,在4 ℃下可稳定3个月.

6)磷标准储备液：称取0.439 4 g磷酸二氢钾溶于约200 mL水中,加入浓硫酸5 mL,然后转移于1 000 mL容量瓶中加水定容,摇匀,贮于棕色瓶中.此为100 μg mL-1的磷标准储备液.

7)磷标准工作液(5 μg mL-1)：吸取磷标准储备液5 mL稀释至100 mL.

8)二硝基酚溶液：称取0.2 g 2,4-二硝基酚或2,6-二硝基酚溶于100 mL水中,贮于玻璃瓶中.

9)硫酸溶液(1 mol L-1H2SO4)：在不断摇动下,将55 mL浓硫酸缓缓加入盛有约800 mL水的容量瓶中,冷却后定容至1 000 mL.

1.1.2 待测液制备 称取过1 mm筛的风干土2.50 g于150 mL锥形瓶中,加入50 mL浸提剂,塞紧置于恒温往复振荡器上,在(25±1)℃下,以180～200 r/min震荡30 min,立即用无磷滤纸过滤,滤液应当天分析.

1.1.3 标准曲线 分别吸取标准工作液0、1、2、3、4、5 mL于6个50 mL容量瓶中,用浸提剂补充至10 mL,分别加水至15～20 mL左右,加入1滴二硝基酚指示剂,混匀,逐滴加入硫酸溶液至接近无色,加入0.75 mL抗坏血酸溶液,混匀,30 s后加入5 mL钼锑储备液,用水定容至50 mL,摇匀,在大于20 ℃的条件下放置30 min.然后在880 nm处测定吸光度,标准磷的系列浓度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μg mL-1.

1.1.4 待测液的测定 吸取10 mL滤液于50 mL容量瓶中,加水至15～20 mL左右,加入1滴二硝基酚指示剂,混匀,逐滴加入硫酸溶液至接近无色,加入0.75 mL抗坏血酸溶液,混匀,30 s后加入5 mL钼锑储备液,用水定容至50 mL,摇匀,在大于20 ℃的条件放置30 min.然后在880 nm处测定吸光度.

1.2 方法2：农业标准NY/T 1121.7—2014的操作[8]

1.2.1 试剂配制

1)氢氧化钠溶液(NaOH,10%)：同1.1.1 1).

2)浸提剂：同1.1.1 2),如贮存期超过20 d,必须重新校准pH.

3)酒石酸锑钾(3 g L-1)：称取酒石酸锑钾0.3 g溶于100 mL水中.

4)钼锑储备液：称取10.0 g钼酸铵溶于300 mL约60 ℃的水中,冷却.另取181 mL浓硫酸缓缓加入400 mL水中,搅拌冷却.然后将配制好的硫酸溶液缓缓倒入钼酸铵溶液中,再加入100 mL酒石酸锑钾,冷却后定容至1 L,摇匀,贮于棕色瓶中.

5)钼锑抗显色剂：称取0.5 g抗坏血酸溶于100 mL钼锑储备液中,现配现用.

6)磷标准储备液(100 μg mL-1)：同1.1.1 6).

7)磷标准工作液(5 μg mL-1)：同1.1.1 7).

1.2.2 待测液制备 称取过2 mm筛的风干土2.50 g,置于200 塑料瓶中,加入浸提剂50 mL,在(25±1)℃下,以(180±20)r/min震荡30 min,立即用无磷滤纸过滤.

1.2.3 标准曲线 分别吸取磷标准工作液0、1、2、3、4、5 mL于6个50 mL容量瓶中,加入碳酸钠浸提剂10 mL,钼锑抗显色剂5 mL,慢慢摇动,排除CO2后加水定容,即得含磷0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μg mL-1的磷标准系列.在室温高于20 ℃下放置30 min,在880 nm测定吸光度.

1.2.4 待测液的测定 吸取滤液10 mL于50 mL容量瓶中或比色管中,缓慢加入钼锑抗显色剂5 mL,慢慢摇动,排除CO2,再加入水定容,充分摇匀,逐净CO2,在室温高于20 ℃下放置30 min后在880 nm处测定吸光度.

1.3 方法3：改进方法的操作

1.3.1 试剂配制

1)氢氧化钠溶液(NaOH,10%)：同1.1.1 1).

2)浸提剂：0.5 mol L-1碳酸氢钠(pH8.5),称取AR级试剂碳酸氢钠42.00 g,溶于约900 mL纯水中,搅拌溶解后,利用pH计用10%氢氧化钠调节pH至8.5,然后用纯水定容至1 000 mL,转移于塑料瓶中,保存期超过20 d时应检查其pH.

3)钼锑储备液：称取钼酸铵10 g,酒石酸锑钾0.5 g于1 000 mL玻璃烧杯中,加入约700 mL纯水,搅拌2 min,然后边搅拌边沿烧杯壁缓慢加入180.6 mL浓硫酸,充分搅拌至钼酸铵和酒石酸锑钾溶解完全,放冷后,转移至1 000 mL容量瓶中定容,摇匀后转移至棕色试剂瓶中保存.

4)显色剂：按每100 mL钼锑储备液加入1.5 g抗坏血酸,搅拌溶解,临用当天配制.

5)磷标准储备液(100 μg mL-1),同1.1.1 6).

6)磷标准工作液(1 μg mL-1)：吸取磷标准储备液1 mL用纯水稀释至100 mL.

1.3.2 待测液制备 称样过1 mm筛风干土1.00 g于100 mL塑料锥形瓶中,加入浸提剂20 mL,在180 r/min震荡机上震荡30 min,取下用无磷定量滤纸,过滤于干净的锥形瓶中.

1.3.3 标准曲线 吸取1 μg mL-1磷标准工作液0、1、2、3、4、5 mL分别于6个50 mL干净干燥烧杯中,各加浸提剂2 mL,用纯水补至9 mL,各加1 mL钼锑抗显色剂,充分摇匀后在20 ℃以上室温下放置30 min,用1 cm比色皿在880 nm处用纯水调节仪器零点(当土壤含有机质高时,待测液颜色较深,用纯水调节零点,便于通过对比试验消去有机质颜色的影响),依次测定此标准系列的吸光度.该标准系列对应的磷浓度为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μg mL-1.

1.3.4 待测液的测定 吸取滤液2 mL于小烧杯中,分别加入7 mL纯水和1 mL显色剂,充分摇匀后在高于20 ℃的室温下放置30 min后,同标准曲线一样在880 nm处测定吸光值.

对于有机质含量高且滤液颜色较深的土样时,可以另吸2 mL滤液于小烧杯中,加水7 mL,加入钼锑储备液1 mL,充分摇匀后测定吸光度,以此作为对比试验.用加显色剂的吸光度减去对比试验的吸光度,即可消除滤液颜色的影响.如果样品滤液无色或颜色较淡,可不用做对比实验.

2 结果

2.1 标准曲线表1可见,从吸光度来看,方法2的吸光度最高,方法1的吸光度最低,方差分析表明,方法1的吸光度显著低于方法2和方法3,方法2与方法3的吸光度之间无显著差异.从相关系数来看,方法1标准曲线的相关系数低于方法2和方法3,而方法2和方法3之间差异不明显.通过标准曲线的回归方程可以计算出摩尔吸光系数,方法2和方法3的摩尔相关系数都显著高于方法1,而方法2和方法3之间的摩尔相关系数差异不大.

表1 不同操作方法的标准曲线数据

2.2 方法重现性从表2可见,在速效磷含量低的土壤样品Z中,5次测定结果平均值是方法1>方法3>方法2,但方法1的变系数最大,大于5%,而方法2和方法2的变异系数均小于2%,说明方法1的重现性比方法2和方法3差.在速效磷含量较高的土壤样品L1中,三种方法测定结果差异不显著,但是变异系数依然是方法1最高,在4%以上,而方法2和方法3的变异系数均小于2%.

表2 不同方法的重现性

2.3 方法的回收率分析方法的回收率就是将一定量的标准物质加入到样品中,用测得的总量减去样品中的量,再除以所加入标准物质的量所获得的百分数[7],也称为加标回收率.表3可见,用速效磷含量低的土壤Z做回收率实验,方法1回收率偏低,且变异系数大,方法2和方法3都接近100%,而方法3的变异系数最小.用速效磷含量高的土壤L1做回收率实验,只有方法3最接近100%,变异系数也最小,方法1和方法2回收率都高出100%,以方法1的偏离最大,变异系数也最大.

表3 不同方法的磷的加标回收率

3 讨论

3.1 样品测定流程问题从样品测定的操作流程图即图1可见,方法1的流程最复杂,有8道程序;方法2居中,有6道程序;方法3即本改进方法的流程最简单,只有5道程序.操作流程越复杂,操作误差的来源就越多,系统误差就越大,所以好的方法,应是操作流程越简单越好.由此可见,本改进操作,简化了操作流程,也就减少的操作误差的来源,误差来源减少,就有利于提高重现性和准确性.

图1 三种方法的样品测定流程图

3.2 操作过程的差异三种操作方法的主要差异如表4所示.本改进操作简化了钼锑储备液的配制,只用一个烧杯配制,方法1和方法2都需要用到3个烧杯,而且钼酸铵和酒石酸锑钾的溶解还需要加热促溶.

表4 三种方法操作差异

方法2和本改进方法钼锑液酸度合理,样品测定时不需要调节酸度,显色剂一次性加入,操作简便.

本改进方法的反应容器是烧杯,吸样后定量加水直接加显色剂即可显色,主要优点有：1)加显色剂后直接摇匀放置即可,不需再定容,操作简化;2)由于碳酸氢钠与显色剂反应产生CO2气体,在容量瓶或比色管中摇匀和定容时容易因气泡冲击而溢出液体导致误差,本方法在烧杯反应,空间大,产生的气体很容易被赶走,避免了气泡冲击溢出液体的问题;3)本方法在加入显色剂时,体积已经接近反应的最佳显色环境,每一个重复的体系环境相同,故重现性好,而方法1和方法2在加显色剂时的体积没有接近反应体系的总体积,不是显色的最佳环境,加完显色剂后再定容,中间也需要一定的时间,在这段时间里,反应却已经进行了,而且每个重复里面环境和定容的时间也不尽相同,导致重现性差;4)上机测定时,本方法将显色液倒入比色皿时,非常方便,体积多少容易控制,而方法1和方法2因为容量瓶或比色管的瓶颈效应,往比色皿倒入显色液时,不容易控制体积,稍不注意就会溢出比色皿,需要用吸水纸擦拭,容易污染比色皿表面,从而对吸光度产生影响.

本改进方法减少了样品和试剂用量,与方法1和方法2相比,土壤样品和浸提剂用量减少了60%,钼锑抗显色剂用量减少了80%.虽然三种方法的标准曲线浓度系列都是0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μg mL-1,由于方法1和方法2的显色体积是50 mL,本方法的显色体积是10 mL,则标准磷的用量也减少了80%.试剂用量和样品用量减少,既节约分析测试成本,也减少了废液对环境的污染.

有机质颜色干扰问题：方法1没有考虑这个问题,方法2是通过加入无磷活性碳脱色,而无磷活性炭的制备不仅需要消耗大量的浸提剂和盐酸,而且需要抽滤装置,并耗费较长时间,制备非常麻烦.本方法利用对比实验来消除有机质颜色的干扰,避免了制备无磷活性碳的麻烦和活性碳的加入量不好控制问题,也消除了活性碳可能带来干扰.

3.3 方法的精确度和准确度分析方法的变异系数是同一样品多次测定值的标准差占平均值的百分数,变异系数可以反映方法的精确性,变异系数小,说明精确度高,代表性好;精确度高,也表明测定方法稳定,重现性好[9].分析数据表明,无论是对于低含量样品还是高含量样品,方法1的变异系数最大,本方法的变异系数最小,说明本方法的精确度高,重现性及稳定好.

加标回收率是实验室常用的确定准确度和进行质量控制的方法之一,可以验证方法的实用性、准确性和可靠性[10-11];加标回收率既可以反映准确度,也可以判断方法的精确度[12].一般回收率在80%～120%之间,则该方法可能适合有关样品分析,回收率越接近100%,说明结果越准确[7].由实验数据可见,在土壤速效磷含量低的样品中,三种方法的回收率均在此范围内(80%～120%),而且方法2和本方法非常接近100%;在土壤速效磷含量高的样品中,方法1高出此范围,方法2和本方法在此范围内,但本方法最接近100%,且回收率的变异系数最小.标准曲线的相关性也可反映方法的准确度,方法2和本方法的相关系数非常接近于1,而且比方法1大,进一步说明本方法准确性好.摩尔吸光系数可反映方法的灵敏度,本方法的摩尔吸光系数与方法2无显著差异、但显著高于方法1,说明本方法灵敏度比方法1高.

4 结论

同传统方法相比,本操作方法优化了试剂配制,简化了实验操作,改变了反应容器,省去了定容操作,使显色反应体系更加接近最佳状态,避免显色、比色等环节中容易导致误差的操作,从而提高了方法准确度和精密度,同时极大地减少了样品和试剂消耗,通过对比试验消除有机质颜色的干扰,不需要使用无磷活性炭,既节约了成本又节省了时间,是值得在土壤速效磷测定中推广应用的操作方法.