塔拉粉酶解废液HPLC指纹图谱及2个主成分含量测定方法研究

管勤昊, 汤丽华, 张亮亮, 徐 曼, 刘义稳, 黄立新*

(1.中国林业科学研究院 林产化学工业研究所;江苏省生物质能源与材料重点实验室;国家林业和草原局林产化学工程重点实验室;林木生物质低碳高效利用国家工程研究中心,江苏 南京 210042;2.南京林业大学 江苏省林业资源高效加工利用协同创新中心,江苏 南京 210037; 3.华侨大学 先进碳转化技术研究院,福建 厦门 361021; 4.五峰赤诚生物科技股份有限公司,湖北 宜昌 443000)

塔拉是一种分布于南美洲西北部的豆科植物,是提取植物单宁的重要原料。近年来,随着国内五倍子价格飙升,很多厂家已转向进口塔拉粉生产塔拉单宁以取代五倍子单宁,或用来制备工业没食子酸及其衍生物[1]。塔拉单宁是塔拉粉中的主要成分,属于水解类没食子单宁,其化学结构式为多没食子酸酰基奎宁酸,在酸、碱或酶的催化作用下可以水解为奎宁酸和没食子酸[2-4]。工业上,通常采用塔拉粉水解制备没食子酸,该过程废液中会残存大量奎宁酸[5-6]。奎宁酸,通常于金鸡纳树皮中提取加工获得,又名金鸡纳酸[7],可以促进链球菌的生成和促进心、子宫等器官组织的发育[8],还可以作为饲料添加剂和改善酒精饮料口感、烟草增香剂的替代品等,其用途较为广泛[9-10]。没食子酸,化学名称为3,4,5-三羟基苯甲酸,研究表明没食子酸对人体健康存在多种有益效果,具有抗炎[11]、抗突变[12]、抗氧化[13]、抗自由基[14]等多种功效。目前,针对奎宁酸及没食子酸的检测方法主要以HPLC法为主,但至今仍没有制定统一的奎宁酸含量分析行业标准和国家标准,测定样品时需要对流动相、配比、流速、柱温等条件进行相应的选择[15-18]。本研究建立了一种同时分析塔拉粉酶解废液中奎宁酸和没食子酸的HPLC方法,将废液中各组分进行分离,并对其中没食子酸和奎宁酸含量进行检测;同时通过指纹图谱、相似度、聚类分析等手段对不同批次塔拉粉酶解废液进行评价,以期为进一步从废液中回收奎宁酸提供基础数据。

1 实 验

1.1 原料、试剂与仪器

塔拉粉酶解废液,由四川亭江新材料股份有限公司提供。三氟乙酸(色谱纯)、乙腈(色谱纯)、没食子酸(纯度99%),国药集团化学试剂有限公司;奎宁酸标准样品(纯度≥99%),东京化成工业株式会社。

岛津LC AB20高效液相色谱(HPLC)仪(带自动进样器),日本岛津公司;Zorbax C18色谱柱(150 mm×4.6 mm,5 μm),安捷伦仪器有限公司。

1.2 色谱条件

采用Zorbax C18 色谱柱,流动相为0.1%三氟乙酸水溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脱程序为:0～5 min 95% A,5～7 min 80% A,7 min以后95% A;UV检测器,检测波长215 nm,柱温30 ℃,流速1.0 mL/min,进样量10 μL,运行时间7 min。

1.3 试样制备

取塔拉粉酶解废液10 mL,抽滤过0.45 μm滤膜,然后取抽滤后液体1 mL加水定容至100 mL,并根据要求进行稀释,即得试样溶液。将所得试样溶液过0.22 μm滤膜至2 mL透明螺纹口样品瓶中,待测。

1.4 奎宁酸和没食子酸标准曲线绘制

准确称取(105±2) ℃下烘干至质量恒定的奎宁酸标准样品200 mg,加水超声波处理至完全溶解,定容至10 mL,即得20 g/L奎宁酸标准溶液。采用倍比稀释法,将20 g/L奎宁酸标准溶液稀释至10、 5、 2.5和1.25 g/L,然后将所得系列浓度标准溶液过0.22 μm滤膜至2 mL透明螺纹口样品瓶中,待测。

准确称取(105±2) ℃下烘干至质量恒定的没食子酸标准样品100 mg,加水超声波处理至完全溶解,定容至100 mL,即得1 g/L没食子酸标准溶液。采用倍比稀释法,将1 g/L没食子酸标准溶液稀释为0.5、 0.25、 0.125和0.062 5 g/L,然后将所得系列浓度标准溶液过0.22 μm滤膜至2 mL透明螺纹口样品瓶中,待测。

按1.2节色谱条件,通过HPLC仪测试,记录色谱图以及相应峰面积,以保留时间作为定性标准,以标准溶液质量浓度(g/L)为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制奎宁酸与没食子酸标准曲线。

1.5 混合对照样品制备

准确称取(105±2) ℃下烘干至质量恒定的奎宁酸标准样品200 mg、没食子酸标准样品10 mg,加水超声波处理至完全溶解,定容至10 mL,即得20 g/L奎宁酸和1 g/L没食子酸的混合对照样品溶液,采用倍比稀释法,稀释为10 g/L奎宁酸和0.5 g/L没食子酸、 5 g/L奎宁酸和0.25 g/L没食子酸混合对照样品溶液。

1.6 方法学考察试验

1.6.1精密度试验

1.6.1.1日内精密度 按1.3节制备试样1份,按1.2节色谱条件,通过HPLC测试,记录色谱图以及相应峰面积,以保留时间作为定性标准,于1日内间隔3 h连续测试该试样溶液6次,计算RSD值。

1.6.1.2日间精密度 按1.3节制备试样1份,按1.2节色谱条件,通过HPLC测试,记录色谱图以及相应峰面积,以保留时间作为定性标准,3日内每日重复测试该试样溶液3次,计算RSD值。

1.6.2重复性试验 按1.3节制备试样6份,按1.2节色谱条件,通过HPLC测试,记录色谱图以及相应峰面积,以保留时间作为定性标准,计算RSD值。

1.6.3稳定性试验 按1.3节制备试样6份,按1.2节色谱条件,通过HPLC测试,记录色谱图以及相应峰面积,以保留时间为定性标准,分别于制样后0、 2、 4、 8、 12和24 h测试试样溶液,计算RSD值。

1.6.4加样回收试验 精密移取已测定奎宁酸及没食子酸含量的试样3份,每份0.5 mL,分别加入1.5节制备的混合对照样品溶液0.5 mL,按1.2节色谱条件,通过HPLC测试,记录色谱图以及相应峰面积,以保留时间作为定性标准,计算加样回收率。

1.7 指纹图谱建立

取12批次塔拉粉酶解废液,按1.3节方法制备试样溶液,按1.2节色谱条件,通过HPLC测试,记录色谱图和相应峰面积,以保留时间作为定性标准,采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012A 版)对12批次试样的HPLC图谱进行分析。

1.8 聚类分析

采用SPSS 23.0统计软件,以12批次塔拉粉酶解废液HPLC峰面积为变量,对12批次试样进行聚类分析。

1.9 含量计算

废液中奎宁酸和没食子酸质量浓度按下式计算:

X=C×V×n/V0

式中:X—废液中奎宁酸或没食子酸质量浓度,g/L;C—根据标准曲线计算得到的试样溶液中奎宁酸或没食子酸质量浓度,g/L;V—试样溶液定容体积,mL;V0—取抽滤后废液体积,mL;n—试样溶液稀释倍数。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件选择

2.1.1检测波长 奎宁酸及没食子酸紫外吸收光谱如图1所示。由图1可知,奎宁酸在190～250 nm范围内紫外吸收随波长增加而下降,在250～500 nm范围内紫外吸收几乎为0;而没食子酸存在2个吸收峰,其波长分别为215和265 nm。如图2所示,1分子塔拉单宁可以水解产生4～6分子没食子酸和1分子奎宁酸,故酶解液中奎宁酸含量相对较低。溶剂的紫外截止波长是指当小于截止波长的辐射通过溶剂时,溶剂对此辐射产生强烈吸收,它严重干扰组分的吸收测量。考虑到截止波长对光谱产生的影响,选择215 nm作为奎宁酸与没食子酸检测波长。

图2 塔拉单宁水解过程

2.1.2流动相选择 对比了不同的流动相体系,包括甲醇-0.1%三氟乙酸水溶液、乙腈-0.1%三氟乙酸水溶液、丙酮-0.1%三氟乙酸水溶液,由于各流动相紫外吸收截止波长不同,乙腈、甲醇和丙酮的紫外吸收截止波长分别为190、 205和330 nm,由于小于截止波长的辐射通过溶剂时,溶剂对此辐射产生强烈吸收影响试验结果,故紫外吸收截止波长对工作波长215 nm影响最小的乙腈为最佳流动相[19]。

2.1.3流动相梯度、流速、柱温选择 考察了不同流动相梯度、流速和柱温,结果见图3。由图3中不同流速、柱温的对比结果可知,提高流速会导致出峰时间过早、易受溶剂峰等因素影响,柱温对出峰时间影响不大。流动相乙腈梯度为5%～20%、 5%～40%、 5%～60%、 5%～80%时,对出峰时间无显著影响,故选择5%～20%乙腈为流动相。综合考虑,选择流速1.0 mL/min、乙腈梯度5%～20%、柱温30 ℃作为高效液相色谱工作条件。

图3 流动相(乙腈)梯度、流速和柱温对比Fig.3 Comparison of flow phase(acetonitrile) gradient, flow velocity and column temperature

2.1.4奎宁酸、没食子酸标准曲线绘制 按照1.4节条件绘制奎宁酸、没食子酸标准曲线,并拟合线性回归方程。经测试,奎宁酸检测限为0.5 g/L、没食子酸检测限为5 mg/L。奎宁酸标准曲线的线性回归方程为:y=280 722x-72 680(R2=0.999 6),线性范围为1.25～20 g/L;没食子酸标准曲线的线性回归方程为:y=43 148 700x+1 983 150(R2=0.999 3),线性范围为0.062 5～1 g/L。

2.2 方法学考察结果

2.2.1精密度试验

2.2.1.1日内精密度 日内精密度测试结果发现,奎宁酸与没食子酸峰面积范围分别为1 325 613～1 334 174、 18 832 967～19 080 484(n=6),保留时间范围分别为3.17～3.18 min、 3.92～3.98 min(n=6),峰面积RSD分别为0.241%、 0.496%(n=6),保留时间RSD分别为0.129%、 0.579%(n=6),均小于5%,说明该方法日内精密度良好。

2.2.1.2日间精密度 日间精密度测试结果发现,奎宁酸与没食子酸峰面积范围分别为1 283 069～1 397 839、 17 653 576～18 878 864(n=9),保留时间分别为3.16～3.29 min、 3.89～4.18 min(n=9),峰面积RSD分别为2.390%、 2.827%(n=9),保留时间RSD分别为1.334%、 3.006%(n=9),均小于5%,说明该方法日间精密度良好。

2.2.2重复性试验 重复性试验发现,奎宁酸与没食子酸峰面积范围分别为1 096 959～1 183 619、 16 862 905～17 480 248(n=6),保留时间分别为3.13～3.16 min、 3.88～3.89 min(n=6),峰面积RSD分别为3.152%、 1.538%(n=6),保留时间RSD分别为0.388%、 0.133%(n=6),均小于5%,说明该方法重复性良好。

2.2.3稳定性试验 稳定性试验结果发现,奎宁酸与没食子酸峰面积范围分别为1 236 521～1 284 303、 18 193 401～18 976 851(n=6),保留时间分别为3.20～3.35 min、 4.07～4.28 min(n=6),峰面积RSD分别为1.289%、 1.770%(n=6),保留时间RSD分别为2.178%、 1.883%(n=6),均小于5%,说明该方法24 h内具有较高的稳定性。

2.2.4加样回收试验 加样回收试验结果见表1和表2,奎宁酸与没食子酸平均加样回收率分别为100.87%、 99.65%,奎宁酸与没食子酸加样回收率RSD分别为3.273%、 2.568%。

表1 加样回收试验峰面积与质量浓度测定结果

表2 加样回收率计算结果

2.3 指纹图谱分析

混合对照品的HPLC图谱见图4。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012A 版)对12批次试样的HPLC图谱进行分析[20],HPLC指纹图谱见图5。由图5可以标定出3个共有峰,通过与图4混合对照品对比,共指认出2个峰,分别为奎宁酸(1号峰)与没食子酸(3号峰),将12批次废液指纹图谱与对照图谱进行比较,得到各个指纹图谱与对照指纹图谱相似度均大于0.95(表3),说明不同批次废液间样品差异小,废液内容物稳定。

表3 12批样品与对照指纹图谱相似度结果

图4 混合对照品的HPLC图谱Fig.4 HPLC chromatogram of mixed reference substance

图5 12批次废液试样(S1～S12)和对照品(R)指纹图谱

2.4 聚类分析

聚类分析可以将不同样本按照性质进行分组,使得组间个体相似性较小[21]。将12批次废液试样标定的奎宁酸与没食子酸峰面积导入SPSS 23.0软件,利用Z-得分对数据进行标准化处理,以欧式平方距离为距离测度,采用组间连接法进行Q型聚类,聚类分析结果见图6。由图可知,当类间距为5时,12批次试样被分为2类,S10与S11聚为一类,其余样品聚为另一类,说明10、 11号试样与其他试样差距较大,但总体来说12批次废液试样样品间差距较小。

图6 12批次废液试样聚类树状图Fig.6 12 batches of waste liquid samples clustering tree diagram

2.5 试样含量计算结果

按1.3节制备试样,按1.2节色谱条件,通过HPLC测试,连续进样3次,记录色谱图以及相应峰面积,以保留时间作为定性标准,计算得到试样中奎宁酸质量浓度为482.3 g/L(平均保留时间3.191 min),没食子酸质量浓度为35.7 g/L(平均保留时间3.965 min)。

3 结 论

3.1首次对塔拉粉酶解废液中2种主成分进行测定,建立了同时检测奎宁酸与没食子酸的高效液相色谱方法,该方法选择215 nm作为奎宁酸与没食子酸检测波长,色谱条件为流速1.0 mL/min、乙腈梯度5%～20%、柱温30 ℃。奎宁酸标准曲线线性范围为1.25～20 g/L、没食子酸标准曲线线性范围为0.062 5～1 g/L,奎宁酸与没食子酸检测限分别为0.5 g/L、 5 mg/L。奎宁酸与没食子酸日内精密度保留时间RSD分别为0.129%、 0.579%,日间精密度保留时间RSD分别为1.334%、 3.006%,重复性保留时间RSD分别为0.388%、 0.133%,稳定性保留时间RSD分别为2.178%、 1.883%,平均加样回收率分别为100.87%、 99.65%,平均加样回收率RSD分别为3.273%、 2.568%。表明该方法准确度高、重复性强,可以作为新方法弥补现有塔拉粉酶解废液分析的不足。

3.2建立了塔拉粉酶解废液指纹图谱,共标定出3个共有峰,相似度均大于0.95,说明建立指纹图谱具有较好的稳定性与可控性,通过共有峰指认可确定奎宁酸(1号峰)与没食子酸(3号峰)。选取12批次废液试样进行聚类分析,结果表明样品间差距较小。

3.3对塔拉粉酶解废液中奎宁酸与没食子酸含量进行计算,得到奎宁酸质量浓度为482.3 g/L,没食子酸质量浓度为35.7 g/L。该方法填补了现有分析技术中对酶解塔拉粉制备没食子酸废液检测方法的空白,同时为从塔拉粉酶解废液中回收奎宁酸提供了基础。