Sprouty2蛋白调节去势抵抗性前列腺癌细胞增殖、迁移和凋亡的机制研究

姜涵中,王立森,孙立江

(1.青岛大学医学院,山东 青岛 266071;2.莱州市中医院,山东 烟台 261400;3.青岛大学附属医院,山东 青岛 266071)

我国癌症中心统计数据[1]显示,从2008年起,前列腺癌已发展成为我国男性泌尿系统发病率最高的恶性肿瘤,与欧美发达国家前列腺癌流行特点不同,我国前列腺癌患者不仅基数大,而且确诊时多已出现局部转移或远处转移[2].多数前列腺癌患者在接受内分泌治疗初期效果明显,但随着疗程的延长,至中位时间20～24个月时,几乎所有患者均会出现不同程度的去势抵抗,降低了之前治疗方案的疗效,增加了治疗难度[3].因此,探讨前列腺癌趋势抵抗的发生机制对改善治疗预后具有重要意义.快速发育生长因子同源蛋白2抗体(Sprouty2)蛋白在多种肿瘤组织中呈低表达,作为负性调节蛋白参与调控肿瘤的发生与发展[4],但目前关于去势抵抗性前列腺癌中Sprouty2蛋白表达特点的研究仍十分少见.本研究主要探讨Sprouty2蛋白调节去势抵抗性前列腺癌细胞增殖、迁移和凋亡的机制.

1 材料与方法

1.1 材料与主要试剂

人去势抵抗性前列腺癌细胞(上海赛百慷生物技术有限公司);RPMI1640细胞培养基、胰蛋白酶、胎牛血清(北京诺为生物技术有限公司);噻唑蓝(MTT)细胞增殖检测试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒(泽叶(上海)生物科技有限公司);鼠抗人Myc促癌基因(c-Myc)单克隆抗体、鼠抗人SRY盒转录因子4(Sox4)单克隆抗体、兔抗人E-box结合同源盒1(ZEB1)单克隆抗体、鼠抗人E-钙黏蛋白单克隆抗体、鼠抗人波形蛋白单克隆抗体及山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG(上海默瑞生物科技有限公司).

1.2 方 法

1.2.1 细胞培养与分组

人去势抵抗性前列腺癌细胞使用含10%胎牛血清、青霉素和链霉素的RPMI1640细胞培养基培养.根据实验目的分为Sprouty2蛋白高表达组和阴性对照组:Sprouty2蛋白高表达组通过siRNA技术将小激活RNA(saRNA)转入人去势抵抗性前列腺癌细胞中进行干预;阴性对照组:通过siRNA技术将空载体质粒转入人去势抵抗性前列腺癌细胞中进行干预;空白对照组:进行常规培养;取对数生长期细胞用于后续实验.

1.2.2 细胞增殖情况测定

将3组人去势抵抗性前列腺癌细胞接种到96孔板中,细胞密度5×104/mL,100 μL/孔,CO2培养箱中培养,温度设定为37 ℃.光学显微镜下观察细胞贴壁生长后再加入MTT继续培养4 h,弃去上清液,加入二甲基亚砜150 μL/孔,震荡混匀,使用酶标仪读取450 nm处的吸光度值.每组均设置7个平行对照孔,同时设置二甲基亚砜对照孔.

1.2.3 细胞迁移能力测定

将3组人去势抵抗性前列腺癌细胞接种到6孔板中,光学显微镜下观察细胞融合度超过90%时使用移液枪头垂直划痕,每间隔24 h在显微镜下拍照,测量划痕宽度变化情况,并计算划痕愈合率.

1.2.4 细胞凋亡情况测定

使用胰蛋白酶消化3组人去势抵抗性前列腺癌细胞,收集5×104个细胞制作单细胞悬液,磷酸缓冲液清洗3次,离心收集沉淀,室温、避光调节下加入Annexin V-FITC染色人去势抵抗性前列腺癌细胞5 min,之后再加入PI染色5 min,上流式细胞仪测定细胞凋亡情况.

1.2.5 Western blot测定c-Myc、Sox4、ZEB1蛋白、E-钙黏蛋白、波形蛋白表达

通过RIPA细胞裂解液提取空白对照组、阴性对照组、Sprouty2蛋白高表达组人去势抵抗性前列腺癌细胞的总蛋白,冰上裂解1 h,离心收集上层蛋白.BCA试剂盒测定蛋白浓度,行10% SDS-PAGE电泳分离,采用湿电转膜仪将目标蛋白转移到PVDF膜,使用5%脱脂奶粉在室温环境下封闭1 h,滴加一抗:鼠抗人c-Myc单克隆抗体(稀释倍数1∶300)、鼠抗人Sox4单克隆抗体(稀释倍数1∶1 000)、兔抗人ZEB1单克隆抗体(稀释倍数1∶500)、鼠抗人E-钙黏蛋白单克隆抗体(稀释倍数1∶700)、鼠抗人波形蛋白单克隆抗体(稀释倍数1∶500)、鼠抗人β-actin单克隆抗体(稀释倍数1∶1 000),4 ℃冷藏8 h,次日滴加山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG,均为1∶4 000稀释,室温下孵育1.5 h,ECL显影.使用Image J软件读取各条带的灰度值.

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 各组细胞Sprouty2蛋白表达水平

本研究结果显示,Sprouty2蛋白免疫细胞百分比、Sprouty2蛋白免疫细胞荧光强度在各组间比较差异均具有统计学意义(P<0.05),其中,Sprouty2蛋白高表达组Sprouty2蛋白免疫细胞百分比、Sprouty2蛋白免疫细胞荧光强度明显高于阴性对照组和空白对照组(P<0.05).见表1.

表1 各组细胞Sprouty2蛋白表达水平

2.2 各组细胞增殖情况

本研究结果显示,培养开始时细胞增殖活力在各组间比较差异无统计学意义(P>0.05).培养1、2、3、4、5 d时,Sprouty2蛋白高表达组细胞增殖活力明显低于阴性对照组和空白对照组(P<0.05);细胞增殖活力在阴性对照组与空白对照组之间比较差异无统计学意义(P>0.05).见表2.

表2 各组细胞增殖情况

2.3 各组细胞迁移和凋亡能力

本研究结果显示,Sprouty2蛋白高表达组细胞迁移率明显低于阴性对照组和空白对照组,细胞凋亡率明显高于阴性对照组和空白对照组(P<0.01);细胞迁移率和细胞凋亡率在阴性对照组与空白对照组之间比较差异无统计学意义(P>0.05).见表3.

表3 各组细胞迁移和凋亡能力

2.4 各组c-Myc、Sox4、ZEB1蛋白、E-钙黏蛋白、波形蛋白表达情况

本研究结果显示,Sprouty2蛋白高表达组c-Myc、Sox4、ZEB1蛋白、波形蛋白表达水平明显低于阴性对照组和空白对照组,E-钙黏蛋白表达水平明显高于阴性对照组和空白对照组(P<0.01);c-Myc、Sox4、ZEB1蛋白、E-钙黏蛋白、波形蛋白表达水平在阴性对照组与空白对照组之间比较差异无统计学意义(P>0.05).见图1、表4.

1.空白对照组;2.阴性对照组;3.Sprouty2蛋白高表达组.

表4 各组c-Myc、Sox4、ZEB1蛋白、E-钙黏蛋白、波形蛋白的表达量

3 讨 论

美国癌症协会2020年发布的数据[5]显示,前列腺癌的发病率位列男性常见恶性肿瘤的首位,死亡率位列第二位,仅低于肺癌.随着我国人口老龄化的加剧,前列腺癌的发病率和患者数均呈快速增长趋势[6].目前,临床治疗前列腺癌的手段包括手术、放化疗、内分泌治疗等,其中手术和内分泌治疗的机制是阻断雄激素合成或与受体结合,促进前列腺癌细胞凋亡,以达到治疗目的[7].但随着治疗时间的延长,多数前列腺癌患者会出现去势抵抗,导致雄激素剥夺治疗效果明显降低,易出现骨转移,死亡率很高[8].如何实现对去势抵抗性前列腺癌精准、有效治疗,是该领域研究热点之一.探讨去势抵抗性前列腺癌的发病机制,是研发新治疗方案的前提.Sprouty是最先发现于果蝇气管分支中的负性调节蛋白,包括4个家族成员,其中Sprouty2广泛分布于组织器官,具有高度保守性,与另外3个家族成员相比,对RTK信号通路的抑制作用更明显[9].相关研究[10-11]显示,乳腺癌组织中Sprouty2蛋白表达水平明显低于正常乳腺组织;卵巢癌组织中Sprouty2蛋白表达水平低于癌旁正常组织,且Sprouty2低表达患者的无进展生存期明显短于高表达患者.提示Sprouty2蛋白可能作为抑癌因子参与恶性肿瘤的发生与发展,但其表达与去势抵抗性前列腺癌的关系及作用机制的研究报道仍十分少见.

本研究结果显示,培养1～5 d时,Sprouty2蛋白高表达组细胞增殖活力明显低于阴性对照组和空白对照组(P<0.05);Sprouty2蛋白高表达组细胞迁移率明显低于阴性对照组和空白对照组,细胞凋亡率明显高于阴性对照组和空白对照组(P<0.05).提示Sprouty2蛋白高表达能够抑制去势抵抗性前列腺癌细胞的增殖和迁移,促进细胞凋亡,并发挥抗去势抵抗性前列腺癌的作用.c-Myc基因属于Myc基因家族成员,Myc基因是一组癌基因,能够促进细胞的增殖、分化和转移[12].SOX4能够诱导乳腺癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤的上皮间质转化,促进肿瘤细胞转移[13-14];但前列腺癌中SOX4的作用研究仍十分少见.ZEB1蛋白是一种具有促进细胞转移和干细胞特征的转录因子,与子宫内膜癌患者的病理特征密切相关[15],同时能够诱发乳腺癌对放疗耐受性的产生[16].E-钙黏蛋白是多种上皮癌细胞生长和侵袭的抑制蛋白,当E-钙黏蛋白丢失会增加重量细胞的侵袭能力[17].波形蛋白属于中间丝蛋白,具有多种生物学功能,在上皮间质转化中发挥重要作用,其高表达能够促进肿瘤细胞的转移[18].本研究结果显示,Sprouty2蛋白高表达组c-Myc、Sox4、ZEB1蛋白、波形蛋白表达水平明显低于阴性对照组和空白对照组(P<0.05),E-钙黏蛋白表达水平明显高于阴性对照组和空白对照组(P<0.05).提示Sprouty2蛋白高表达可能通过下调c-Myc、Sox4、ZEB1蛋白、波形蛋白表达,上调Sprouty2蛋白表达抑制去势抵抗性前列腺癌细胞的增殖、迁移和凋亡,本研究能够为去势抵抗性前列腺癌的诊断、病情评估及治疗提供新的思路.