白藜芦醇对5/6 肾切除大鼠肌肉萎缩的保护作用及相关机制*

王蕤婷，李 璐，宫海凤，张玲玲，黄新忠*

(南通大学附属医院肾内科，南通 226001)

慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)现已成为一个全球性公共卫生问题，在接受血液透析的终末期肾病患者中有20%～55%出现肌肉萎缩[1]。肌肉萎缩是指骨骼肌体积和同龄人或自身肌肉以前的状态相比出现下降，导致肉眼或影像学检查可见肌肉缩小的一种疾病[2]。CKD 患者随着病情进展，会出现肌肉萎缩及相关并发症，如肌肉疼痛、无力、疲劳及运动耐力下降等，同时骨折和跌倒的风险也显著升高，大大降低了患者的生活质量及生存率。

肌肉萎缩是一个涉及信号通路和萎缩相关基因转录控制的过程，正常人体内肌节功能的维持主要有3 个蛋白水解系统，分别为胞质钙蛋白酶系统、泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)及自噬-溶酶体系统。肌原纤维蛋白降解需要三类酶的协调作用，其中最主要的就是E3 泛素连接酶[3]。肌肉环状脂蛋白-1(musclering finger-1,MuRF-1)由353 个氨基酸残基组成，包含1 个典型的N 末端环结构域，该结构域是肌肉特异性E3 泛素连接酶之一，在CKD的萎缩肌肉中高度表达，可通过UPS 增加肌肉蛋白水解，促进肌肉萎缩的发生[4]。肌肉萎缩蛋白-1(MAFbx,又名Atrogin-1)也是在骨骼肌中高度表达的E3泛素连接酶之一，指导蛋白质的多泛素化，通过26S蛋白酶体将肌肉蛋白进行水解，发生肌肉萎缩[5]。肌肉生长抑制素(Myostatin)也称为生长和分化因子-8(growth and differentiation factor-8,GDF-8)，是分泌型生长因子TGF-β 超家族的成员，是现知的肌肉质量负性调节因子，在TGF-β 超家族中具有独特性，几乎只表达于骨骼肌谱系[6]。肌营养不良蛋白(dystrophin)是肌肉细胞中一种关键的细胞骨架结构蛋白，位于肌纤维中肌膜的内层，可连接细胞内区域与细胞外基质蛋白，增加肌膜连接处稳定性[7]，保护肌纤维在收缩期间保持稳定[8]。Dystrophin 表达的减少或合成的提前会使肌膜连接处稳定性下降，诱导肌肉萎缩的发生，如单基因遗传疾病杜氏营养不良[9]。同时，功能性dystrophin的缺失也会诱导肌纤维膜脆弱，导致进行性肌肉变性，诱导肌萎缩[10]。研究[11]表明，dystrophin 在稳定肌膜及对抗肌肉收缩与拉伸中具有关键作用。

白藜芦醇(resveratrol,RSV)又名芪三酚，也称为3,4',5-三羟基二苯乙烯，是一种天然的非黄酮类化合物[12]。已证实，RSV 可预防和减缓多种疾病的进展，如通过调节转录因子和控制小RNA 的表达表现出抗肿瘤的作用。同时，也是潜在的抗衰老剂，可延缓各种生物体的寿命。RSV 其他作用还包括：保护心脏、调节雌激素受体、预防皮肤癌、抗炎性细胞因子、调节免疫等[13]。但其是否能缓解CKD 肌肉萎缩目前尚未见报道。本研究旨在揭示RSV 对5/6 肾切除大鼠肾功能、肾脏组织结构及肌肉纤维的保护作用及相关机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 血清肌酐(serum creatinine,SCr)检测试剂盒、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)检测试剂盒(重庆Biostec)；Masson 三色染色试剂盒、过碘酸-雪夫(periodic acid-schiff,PAS)染色液、HE 染色液(北京Solarbio)；dystrophin 单克隆抗体、Atrogin-1单克隆抗体、MuRF-1 单克隆抗体、Myostatin 单克隆抗体(美国Santa Cruz)；兔抗大鼠GAPDH 单克隆抗体(英国Abcam)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型构建 于南通大学实验动物中心采购雄性6～8 周的健康Sprague-Dawley 大鼠(200～220 g)30 只，随机分成对照组(Sham 组,n=10)、5/6 肾切除组(Nx 组,n=10)、5/6 肾切除+RSV 干预组(Nx+RSV组,n=10)。动物实验获南通大学动物实验伦理委员会批准(伦理审批号：SYXK(苏)2022-0046)。按照两步法进行CKD 模型构建：10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔内注射进行麻醉，在大鼠右肋下脊直肌外侧剪开皮肤及肌肉，暴露肾脏，分别在肾脏上、下两极切除右肾的2/3，随后逐层缝合，然后常规饲养。1 周后剪开左侧背部皮肤暴露左侧肾脏，结扎肾蒂，切除整个左侧肾脏。Sham 组采用相同的步骤进行手术，未切除肾脏。术后1 周开始予20 mg/(kg·d)RSV 灌胃。术后12 周处死大鼠，收集血液检测肾功能，取肾脏组织切片行病理分析，取胫骨前肌行HE 染色、免疫组织化学及Western Blot 分析。

1.2.2 生化指标测定 大鼠肾功能中SCr、BUN 的测定用ELISA 定量试剂盒，经全自动生化分析仪测定(Modular)。

1.2.3 PAS 染色和Masson 染色 大鼠肾脏组织取出后立即固定于4%多聚甲醛中，进行石蜡包埋，切成3 mm 薄片进行PAS 染色和Masson 染色，然后光镜观察肾脏结构变化。采用半定量分析法计算肾脏肾小球硬化指数(glomerular sclerosis index,GSI)及肾小管间质纤维化指数(tubulointerstitial fibrosis index,TFI)。随机挑选每张切片中20 个不重叠视野进行观察。对肾小球硬化程度划分为5 级：0 级，基本正常；1 级，肾小球硬化面积1%～25%；2 级，＞25%～50%；3级，＞50%～75%；4 级，＞75%～100%。GSI=(1×n1+2×n2+3×n3+4×n4)/每张切片肾小球的总数，nx为肾小球硬化的个数。对肾小管间质纤维化程度也划分为5 级：0 级，所有肾间质均正常；1 级，间质内基质沉积面积＜25%；2 级，基质沉积面积25%～50%；3 级，基质沉积面积＞50%～75%；4 级，基质沉积面积＞75%～100%。TFI=(1×n1+2×n2+3×n3+4×n4)/(n0+n1+n2+n3+n4)，nx为不同纤维化程度视野的数量。

1.2.4 HE 染色 大鼠胫骨前肌组织在4%多聚甲醛中固定48 h，脱水后包埋在石蜡中，切成3 mm 薄片，脱蜡后用HE 染色，普通光镜下观察拍照，使用Image J 软件评估平均肌纤维(cross-sectional area,CSA)。

1.2.5 免疫组织化学染色 大鼠胫骨前肌石蜡切片脱蜡后行常规抗原修复，用蛋白质封闭溶液封闭1 h，滴加一抗(dystrophin 单克隆抗体1∶300) 4 ℃过夜，二抗37 ℃30 min，普通光镜下观察大鼠胫骨前肌肌纤维形态及大小并摄片。

1.2.6 Western Blot 分析 冰上裂解动物肾脏组织和胫骨前肌肌肉组织用于提取蛋白，用BCA 试剂测定总蛋白浓度，20 μg 总蛋白上样量以8%的凝胶电泳进行分离，冰浴下恒压90 V 转膜2 h，5%脱脂牛奶室温封闭1 h 后，用PBS 洗涤3 次，15 min/次，加一抗(Atrogin-1 单克隆抗体1∶1 000、MuRF-1 单克隆抗体1∶1 000、Myostatin 单克隆抗体1∶1 000、GAPDH单克隆抗体1∶5 000) 4 ℃过夜。与HRP 标记的二抗室温孵育2 h 洗膜，用增强裂化学发光试剂(Millipore,WBKLS0100)进行曝光，利用灰度分析软件Image J 进行定量分析，以目的蛋白与内参的灰度值比值计算各目的蛋白的相对表达量。

1.3 统计学方法 采用Origin 2018 64 Bit 软件进行统计分析和绘图，所有数据以±s 表示。两组间比较，正态分布采用t 检验。采用GraphPad Prism5.0 对多组数据进行分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RSV改善5/6 肾切除大鼠肾功能 ELISA 结果显示，与Sham 组相比，从第2 周开始，Nx 组大鼠的肾功能开始下降，肾功能中SCr、BUN 水平明显升高，进行RSV 干预后有所改善，见图1。

图1 5/6 肾切除大鼠肾功能变化

2.2 RSV 改善5/6 肾切除大鼠肾脏病理 PAS 染色和Masson 染色结果显示，Sham 组大鼠肾脏组织学基本正常，Nx 组出现了明显的肾小球硬化、间质纤维化及炎性细胞浸润，RSV 干预后上述异常有所改善。此外，Nx 组大鼠GSI 及TFI 明显增高，RSV 干预有所下降，见图2。

图2 5/6 肾切除大鼠肾组织病理及相关指数变化

2.3 RSV 改善5/6 肾切除大鼠肌肉萎缩 HE 染色显示，Nx 组出现肌纤维紊乱，肌纤维横截面积缩小，RSV 干预后肌纤维横截面积增加；免疫组织化学染色结果显示，Nx 组胫骨前肌dystrophin 的表达减少，RSV 干预增加了dystrophin 表达，见图3。

图3 5/6 肾切除大鼠肌肉纤维变化和dystrophin 表达情况

2.4 RSV 对5/6 肾切除大鼠Atrogin-1、MuRF-1 及Myostatin 的影响 Western Blot 分析显示，与Sham组相比，Nx 组大鼠肌肉中萎缩相关Atrogin-1、MuRF-1 及Myostatin 蛋白表达明显增加，RSV 干预表达降低，见图4。

3 讨论

CKD 在疾病进展过程中往往会伴有肌肉体积缩小、肌肉力量下降等。多年来，国内外学者一直致力于CKD 肌肉萎缩发病机制的研究。X.Y.LIU 等[14]在小鼠成肌细胞中发现，一种新型的叉头转录因子(forkhead transcription factors,FoxOs)调节因子小C 末端结构域核磷酸酶4(the small C-terminal domain phosphatase 4,SCP4)可通过调节FoxOs 的磷酸化，增加其核内聚集，上调Atrogin-1 及MuRF-1 的表达，激活UPS 系统，增加溶酶体介导的蛋白水解，导致CKD肌萎缩。L.J.SUN 等[15]发现，在CKD 小鼠体内萎缩相关的长非编码RNA-1(又称Atrolnc-1)高度表达，高表达的Atrolnc-1 可激活NF-κB，上调MuRF-1，诱导肌肉萎缩。此外，CKD 肌萎缩还与钙磷代谢紊乱、维生素D 缺乏、炎性因子增加及运动减少等有关。本研究结果显示，Nx 组大鼠术后血清SCr、BUN 水平升高，肾脏组织中GSI 及TFI 表达增多，胫骨前肌中CSA 缩小，dystrophin 表达减少，Atrogin-1、MuRF-1、Myostatin 表达增加，说明成功制备了5/6 肾切除CKD大鼠肌肉萎缩模型。

RSV 是一种常见的植物抗毒素，存在于一些食材中，如葡萄皮、花生和红酒等。据报道，RSV 存在多个靶点，如沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,Sirt1)、腺苷酸单磷酸盐(adenosine monophosphate,AMP)、腺苷酸激活蛋白激酶和NF-κB 等[16]。RSV 可通过上述靶点对血管的粥样硬化、高血压、脑卒中、心力衰竭及肌肉萎缩产生保护作用。在糖尿病小鼠肌肉骨骼肌中，RSV 可通过减少泛素及MuRF-1 的表达，下调caspase-3，增加骨骼肌强度及骨骼肌功能，缓解肌肉萎缩[17]。在恶性肿瘤小鼠骨骼肌和心肌中，RSV 可通过抑制NF-κB 的活性，缓解恶性肿瘤诱导的肌肉及心肌萎缩[18]。本研究中与Nx 组比较，Nx+RSV 组大鼠的SCr、BUN、GSI、TFI 表达均减少，胫骨前肌中CSA 增大，dystrophin 表达升高，Atrogin-1、MuRF-1、Myostatin 表达均下降，说明RSV 对CKD 大鼠的肾脏和肌肉具有显著的保护作用。

综上所述，RSV 干预可改善5/6 肾切除大鼠肾功能及肌肉萎缩，其作用机制可能与上调dystrophin，降低Atrogin-1、MuRF-1、Myostatin 表达有关。提示RSV 有望成为临床上治疗CKD 患者肾功能及肌肉萎缩的有效药物，其更详细的机制还需进一步研究，为CKD 肌肉萎缩的治疗提供帮助。