鞭毛主调控因子flhDC 调控机制及其在PGPR 定殖中的功能

刘慧, 蓝明明, 邢蕾蕾

(东北林业大学 生命科学学院, 黑龙江 哈尔滨 150040)

革兰氏阴性菌的鞭毛是其重要的运动器官, 长5～20 μm, 直径约20 nm[1], 能够帮助细菌趋近营养物质, 远离不利生态位。细菌鞭毛由基体、钩型鞘、鞭毛丝3 部分构成。基体包括环 (外膜的L环、肽聚糖层的P 环、内膜的MS 环、胞内C 环)、杆状蛋白 (FlgG、FlgF、FlgC、FlgB、FliE 蛋白组成)、Ⅲ型蛋白质输出装置、定子 (MotA、MotB组成), 负责将鞭毛锚定在细胞膜上。鞭毛丝由FliC 或FljB 螺旋组装而成, 起到推动鞭毛向前运动的作用。钩型鞘由FlgE 组成, 负责基体与鞭毛丝的连接[2-4]。

作为一个结构复杂的大分子运动器官, 革兰氏阴性菌鞭毛的合成至少涉及70 多个基因, 这期间蛋白的生产、组装和运行需要消耗大量能量[5]。鞭毛的级联调控可以有效保证鞭毛合成的高效性。flhDC位于级联调控层次结构的顶部, 是大肠埃希菌、沙门氏菌、奇异变形杆菌等细菌鞭毛合成的一级调节基因和主要调节因子, 在细菌鞭毛生物合成过程中起着关键作用[6]。flhDC直接或间接调控鞭毛生物合成过程中所有结构和成分的转录以应对外界环境和营养的变化, 同时,flhDC也受到诸多环境和生理因素的调控, 并将其整合到鞭毛合成过程[7]。

PGPR 的定殖对于细菌与植物间的相互作用至关重要, 能够在植物根部定殖是PGPR 发挥促生作用的前提[8]。PGPR 在植物根系的定殖过程主要分为3 步: 首先, 鞭毛推动PGPR 朝着宿主植物根部趋化与运动; 其次, 单个PGPR 细胞接触并初步附着于植物根表面; 最后, PGPR 在细胞膜等物质的作用下牢固黏附于根表面, 并在植物根系中长期存活和繁殖[8-10]。flhDC作为细胞的全局调节因子可以调控PGPR 在植物根表定殖过程中的运动和趋化, 参与PGPR 生物膜合成, 提高PGPR 在植物根部的定殖效率。

本文综述了革兰氏阴性菌中鞭毛主调控因子flhDC在转录水平、mRNA 翻译水平、翻译后水平受到的多重调节, 以及flhDC在PGPR 定殖过程中发挥的重要作用。

1 鞭毛主调节因子flhDC 的概述

鞭毛的级联调控使得鞭毛各元件的合成和组装受到时间上严格的调控和管理。根据表达时间的不同将控制鞭毛合成的操纵子分为一级操纵子、二级操纵子和三级操纵子[6,11]。一级操纵子flhDC编码两个基因:flhD和flhC, 这两个基因转录生成相应的蛋白FlhD 和FlhC。FlhD 和FlhC 主要由α-螺旋结构组成, 其中FlhC 含有独特的锌结合结构域[12]。FlhD4C2是由4 个FlhD、2 个FlhC 组成的六聚体复合物。其中, 每一个FlhC 原聚体与一个FlhD 二聚体结合形成D2C, 两个D2C 异质三聚体进行组装最终形成FlhD4C2六聚体[13]。FlhD4C2转录复合体的形成是鞭毛合成的必要条件, 是革兰氏阴性菌二类操纵子的转录激活剂[14]。FlhD4C2识别并结合靶基因起始位点上游约28～88 bp 的位点,在σ70存在的前提下招募RNA 聚合酶, 通过与RNA 聚合酶α 亚基C 末端区域相互作用激活鞭毛二级操纵子的转录[15-16]。

7 个 FlhD4C2依赖型二级操纵子flgAMN、flgBCDEFGHIJ、flhBAE、fliAZY、fliE、fliFGHIJK和fliLMNOPQR编码鞭毛的组装蛋白、相关输出装置及调节蛋白FliA 和FlgM。在HBB (基体) 组装完成之前, 抗σ 因子FlgM 与σ28结合, 从而阻止σ28与RNA 聚合酶相互作用, 抑制下游基因的转录。一旦HBB (基体) 组装完成, 分泌装置的特异性就会发生变化, 将FlgM 从细胞中分泌出去,同时释放FliA, 激活三级操纵子的转录[17-18]。目前, 公认的三级操纵子主要包括flgKL、fliDST、flgMN、fliC、fljBA、tar-tap-cheRBYZ、motABcheAW、tsr、aer, 负责编码鞭毛丝、马达蛋白和趋化蛋白等鞭毛合成后期装配所需的产物[11,15]。

2 鞭毛主调控因子flhDC 受到的多重调节

细菌的运动是极端复杂的过程, 众多全局性调控、群体感应、新陈代谢和环境信号相关因子参与其中, 使得转录因子flhDC 在调控鞭毛合成的同时自身也受到转录、mRNA 翻译、翻译后3 个水平的多重调控 (图1)。

图1 革兰氏阴性菌鞭毛主调控因子flhDC 受多重调节示意图

2.1 flhDC 在转录水平受到的调节

flhDC基因表达受到诸多调控因子的影响, 绝大多数调控因子在flhDC转录水平发挥作用。某些情况下, 环境等因素对基因的调控由调节蛋白介导, 如DNA 复制起始蛋白DnaA[19]、DNA 结合转录双调节因子Lrp[20]、反转刺激因子Fis[21]、DNA结合蛋白HU[22-23]、组蛋白样类核结构蛋白HNS[23-24]。Soutourina 等[25]发 现, 在 大 肠 埃 希 菌(Escherichiacoli) 中, 细菌通过H-NS 调控flhDC的转录以响应外界酸性环境。H-NS 参与染色体组织化, 通过改变flhDC启动子区域的DNA 拓扑结构减少flhDC的转录[6]。另外, H-NS 依赖的flhDC调节因子HdfR 通过与flhDC的上游区域结合也能够抑制细菌的鞭毛合成[26]。Campoy 等[27]发现,在鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonellatyphimurium) 中,DNA 结合转录双调节蛋白Fur 通过与flhDC启动子结合正向调控鞭毛合成。Winter 等[28-30]发现, 在鼠伤寒沙门氏菌中 EnvZ/OmpR 双组分系统和Rcs系统分别对渗透压和包膜应激 (envelope stress)作出响应, 辅助蛋白TviA 整合这两条通路的信号并负向调控flhDC基因和Ⅲ型分泌系统 (T3SS-1)基因的表达, 抑制细菌运动。除此之外, Wang发现, RcsA 作为RcsB 的辅因子进一步加强对鞭毛合成抑制。Kim 等[32-33]在颖壳伯克霍尔德菌(Burkholderiaglumae) 中发现, 群体感应 (QS)相关蛋白QsmR 与flhDC的启动子区结合, 并激活后者表达。此后, Sircili 等[34-35]发现, 在肠致病性大肠埃希菌 (enteropathogenicEscherichiacoli) 中,flhDC基因的转录由群体感应调节器QseB 和QseC激活, 被QseA 抑 制。Soutourina 等[36-37]发 现, 在大肠埃希菌中, 环磷酸腺苷及其受体蛋白的复合物(cAMP-CRP) 可以结合flhDC操纵子调控区域并在此与RNA 聚合酶相互作用, 正向调控flhDC的转录。Shi 等[38]发现, 大肠埃希菌中热休克蛋白DnaK、DnaJ 和GrpE 通过影响flhDC转录影响细菌运动, 从而使细菌对外界温度变化作出反应。

除环境因子外, 还有许多其他调节因子能够在转录水平调控flhDC的表达, 其中大部分是起负调控作用, 抑制flhDC的表达。Mouslim 等[21]发现,沙门氏菌中flhDC基因的启动子区存在DNA 结合转录双重调节蛋白LrhA 和SlyA 的结合位点, 二者通过抑制基因flhDC的转录减少细菌鞭毛的合成。Kakkanat 等[39]发现, 在尿路致病性大肠埃希菌(UropathogenicEscherichiacoli, UPEC) 中, 多药耐药调控蛋白基因mprA、N5-谷氨酰胺甲基转移酶基因hemK和EF-P-赖氨酸转移酶基因yjeA的突变导致flhD和fliC基因转录显著增加。Meng 等[40]发现, 在青枯雷尔氏菌 (Ralstoniasolanacearum) 中,运动相关蛋白MotN 和双组分调节因子VsrA/D 均对flhDC的转录起负调节作用。Thota 等[41]发现,多重耐药调控因子MarA、SoxS、Rob 和RamA 参与调控鼠伤寒沙门氏菌中鞭毛基因的表达, 其中MarA 和Rob 直接与flhDC启动子相互作用, 从而抑制细菌运动。Lemke 等[42]发现, 大肠埃希菌中ppGpp (四磷酸鸟苷) 和RNA 聚合酶结合转录因子DksA 共同调节细胞鞭毛的合成, DksA 和ppGpp与flhDC启动子区域直接且特异性地结合并抑制flhDC转 录。Singer 等[43]发 现, 沙 门 氏 菌 中FlhD4C2蛋白复合物可以激活LuxR 家族转录调节蛋白RflM 基因的转录, RflM 蛋白与flhDC启动子区域结合并抑制flhDC的转录, 进而实现了FlhD4C2对flhDC操纵子的自我反馈调节。除此之外, 还有多种蛋白, 如转录调节蛋白RtsB[44]、DNA 结合转录激活蛋白UvrY[45]、双组分信号转导系统 RssA/B[46]、菌 毛 相 关 调 控 蛋 白 PapX[47]、LuxR 型转录因子MatA[48]和 FimZ[49]、DNA 结合转录抑制因子YjjQ[50]、转录调节因子MrpJ[51]、LysR家庭转录调节蛋白CrgA[52], 均可以通过降低flhDC的转录水平抑制细菌鞭毛的合成。

诸多调控因子通过促进flhDC的转录调控细胞合成 鞭 毛。Mouslim 等[21]发现, 在沙门氏菌中,AraC 家族转录调节器HliD 直接与flhDC的启动子区域结合, 激活flhDC的转录。Dong发现,大肠埃希菌中flhDC操纵子的转录受到RNA 聚合酶Sigma 因子RpoN 的正向调控。Theodorou 等[54]发现, 大肠埃希菌中, 双组分系统AtoS/C 通过增强flhDC和fliAZY操纵子的转录, 参与调节大肠埃希菌的运动性和趋化性。Chen 等[55]发现, 鼠伤寒沙门氏菌中, 反义RNA AsfD 从flhDC操纵子的互补链转录而来, 并覆盖整个flhDC操纵子, AsfD 对细胞运动性和生物膜的增强可能是通过上调flhDC转录水平实现。Rahimpour 等[56]发现, 大肠埃希菌糖原合成调控蛋白基因glgS突变体中,flhDC的转录水平显著降低。Andreozzi 等[57]发现, 转录调节蛋白基因pchE的敲除使得大肠埃希菌中flhDC转录水平下调, 而回补菌株中pchE通过上调flhDC等细菌趋化性、运动性和鞭毛结构相关基因的转录水平促进鞭毛的生物合成和细菌运动。

2.2 flhDC 在mRNA 翻译水平受到的调节

多项研究结果表明, 非编码小RNA (sRNAs)与细胞的氨基酸代谢、碳代谢、金属感应有关, 部分sRNA 参与调控细胞群体感应、生物膜合成、毒力感染、应激适应等过程, 因此, sRNAs 是细胞调控生理过程的关键因素[58]。在大肠埃希菌及沙门氏菌中, 细胞通过精确快速地改变mRNAs 的含量影响蛋白质的合成以应对外界压力与环境变化。sRNAs 通常与RNA 伴侣Hfq 结合, 有助于sRNA与靶mRNA 在flhDCmRNA 的5′未翻译区域 (5′TUR) 的配对, 二者的结合可以增加靶mRNA 的稳定性或招募单链特异性内核糖核酸酶RNase E 对mRNA 进行定向切割, 造成核糖体结合和翻译受阻[59]。

Thomason 等[60]发现, 大肠埃希菌中, 生物膜合成相关的sRNA McaS 可以通过碱基互补配对直接与flhDC的mRNA 结合, 从而避免其不被核酸酶降解, 这一过程增加了flhDCmRNA 的稳定性, 促进细菌鞭毛的合成。Schachterle 等[61-62]发现, 在噬淀粉欧文氏菌 (Erwiniaamylovora) 中, ArcZ 受到ArcB/ArcA 双组分系统的负调节以应对细胞可用氧气的变化, 通过与flhDCmRNA 核糖体结合位点上游区域的直接碱基配对负调节基因flhD和flhC的表达。Romilly 等[63-64]发现, 大肠埃希菌中sRNA OmrA 和OmrB 被EnvZ/OmpR 双组分系统激活转录以响应渗透压变化, 二者通过与flhDCmRNA 相互作用阻碍了flhDC的翻译。De Lay 等[64]发现, 大肠埃希菌中OxyR 通过增加OxyS 的胞内含量以应对细菌的氧化应激, OxyS 与flhDC的碱基互补配对抑制了flhDC的翻译, 减少细胞鞭毛的合成。

除sRNA 外, 部分调节蛋白也参与到flhDCmRNA 稳定性调控中。Yakhnin 等[65]在大肠埃希菌flhDC转录本中发现了RNA 结合调节因子CsrA 的结合位点, 研究表明, CsrA 蛋白通过保护flhDCmRNA 不被RNase E 内切而促进flhDC的表达。

2.3 flhDC 在翻译后水平受到的调节

多种抗FlhD4C2因子能够调节蛋白FlhD4C2的活性, 抑制其对下游二类启动子的激活, 减少鞭毛合成。Yamamoto 等[66]发 现, 鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌(SalmonellaentericaserovarTyphimurium) 中, 鞭毛特异性伴侣蛋白FliT 作为一种抗FlhD4C2因子与FlhD4C2的FlhC 亚单位结合, 从而减少与下游二类操纵子启动子的结合。在基体的组装过程中, 胞质中过量的鞭毛丝帽蛋白FliD 与FliT 结合, 使得FlhD4C2从FliT 中释放出来激活二类操纵子的转录, 促进基体结构蛋白的表达。基体组装完成后,FliD 被运输到细胞外, 游离的FliT 通过与FlhD4C2的相互作用关闭二类操纵子的表达, 这有利于降低细胞鞭毛的合成成本, 避免不必要的能量损耗[67]。Wada发现, 肠道沙门氏菌 (Salmonella enterica) 中抗FlhD4C2因子YdiV 能够与FlhD4C2结合形成一个大的异质复合物, 该过程不仅抑制了FlhD4C2与二类启动子的结合还可以从 DNAFlhD4C2复合物中释放FlhD4C2, 终止二类操纵子的转录。作为一种双功能蛋白, YdiV 还可以将FlhD4C2传递给蛋白酶ClpXP, ClpXP 与FlhD 的C末端结合逐步降解FlhD4C2[70]。Chatterjee 等[71-73]在黑腐果胶杆菌 (Pectobacteriumatrosepticum) 和胡萝卜软腐欧文氏杆菌 (Erwiniacarotovorasubsp.Carotovora) 中发现16S rRNA 甲基转移酶RsmC 可以与FlhD 和FlhDC 复合体结合, 作为抗FlhD4C2因子发挥作用。Li 等[74]发现, 沙门氏菌中类EAL样蛋白STM1697 通过与FlhD4C2的外周FlhD 直接结合限制FlhD4C2招募RNA 聚合酶启动下游基因的转录。

部分调控因子可以通过参与FlhD4C2蛋白的折叠和修饰调控FlhD4C2蛋白活性。Shi 等[38,75]发现, 沙门氏菌中将基因dnaK突变之后, 伴侣蛋白DnaK 参与的多肽折叠和寡聚蛋白激活过程异常,这导致FlhD 和FlhC 组成的复合物在激活下游二类启动子时只保持部分活性。Ma 等[76]在沙门氏菌中发现了一种新型蛋白翻译后修饰, 即应激相关蛋白YdiU 的单磷酸尿苷酸化修饰 (UMP), YdiU 对FlhC 亚基的 Ser31 残基进行修饰, 修饰后的FlhD4C2不能与鞭毛的二类启动子结合, 从而关闭了鞭毛的合成途径。这也是针对FlhD4C2确定的第一个翻译后修饰。

3 flhDC 在PGPR 定殖过程中的作用

随着研究的深入, 越来越多人意识到鞭毛在细菌众多生理过程中发挥了重要的作用, 如PGPR 的定殖过程。由PGPR 制成的根际生防微生物制剂已经被证明是一种能够有效提高植物产量、防治病虫害的安全环保的制剂[77-78]。根际生防微生物制剂的合理使用降低了化学肥料对土壤的污染, 是提高生产力、促进农林经济的有力手段, 同时也为可持续发展提供了有效途径[79-82]。然而, 根际生防微生物制剂的功效可能会受细菌定殖能力的限制。能够在植物根部定殖是PGPR 发挥促生作用的前提。目前影响PGPR 在植物根部定殖的因素主要有: 植物根系分泌物中化学信号和营养物质的种类与浓度; PGPR 的运动性; PGPR 的生物膜合成能力;PGPR 的抗氧化活性; 以及PGPR 逃避和抑制宿主免疫系统等能力[9,83]。鞭毛通常被认为是促进细菌和宿主有益互作的关键成分, 其中, 主调控因子flhDC在PGPR 定殖过程中调控了PGPR 的运动性及生物膜的形成。

3.1 flhDC 调控PGPR 的运动性

在陆生植物中, 根系是植物与微生物互作最主要的场所。植物的根系分泌物可以为微生物提供丰富的营养物质, 对于微生物来说, 根系是非常有吸引力的生态位[10]。鞭毛提供的动力推动PGPR 向宿主根系靠近, 这对于PGPR 在植物根系的定殖十分重要。Barahona 等[84-86]发现, 在PGPR 荧光假单胞菌 (Pseudomonasfluorescens) 中, 当基因flhDC的表达受到抑制时, 鞭毛合成系统部分关闭, 鞭毛数量减少, 这导致PGPR 在植物根部竞争性定殖能力下降。因此,flhDC可以通过调控PGPR 的运动性影响PGPR 在植物根部的定殖。

3.2 flhDC 参与PGPR 生物膜的形成

在植物根表面PGPR 形成生物膜并以黏附的方式进行固着。生物膜是由核酸、脂质、胞外多糖、蛋白质及嵌入其中的微生物组成的胞外基质。与浮游细胞相比, PGPR 生物膜具有更高的生长素(IAA) 产量、固氮酶活性和产氨能力[9]。另外,生物膜为PGPR 提供了保护, 提高其对不良环境的耐受性, 使得PGPR 在土壤恶劣的环境中得以存活且维持较高的生物量, 进一步加强与植物之间的有益 互 作[87]。Thai 等[88]发 现, 伯 克 霍 尔 德 菌 属(Paraburkholderiasp.) 中, 将基因flhDC敲除后,基因缺失突变体的运动性和生物膜形成能力几乎完全丧失。Teplitski 等[89]发现, 在沙门氏菌中基因flhD和flhC的敲除突变体生物膜形成能力有所提高。生物膜形成是一个复杂的调控网络, 受到由鞭毛介导的运动性的双重调控, 但无论是促进还是抑制,flhDC在此过程中都发挥着不可或缺的作用。

总之, 除在鞭毛合成中起着关键作用外,flhDC还是许多非鞭毛基因的全局调节器。flhDC在PGPR 植物根部定殖过程中调控了细菌运动性,参与PGPR 生物膜形成, 提高PGPR 在植物根部的定殖量和定殖效率, 促进了PGPR 与植物间的有益互作。

4 展望

随着人口的增加和社会的发展, 我国对于农林产品的需求也不断增加。化肥、农药、杀虫剂的大量滥用导致土壤肥力和质量下降, 这加剧了脆弱的生态环境的恶化。所以, 近年来更提倡采用更加高效环保的生物肥料和生物防治, 根际生防微生物制剂就是其中之一。土壤、温度、气候、降水量等环境因素造成的迟效性和不稳定性是根际生防微生物制剂目前所要面对的主要问题, 提高 PGPR 在植物根部的定殖能力可以在一定程度上弥补这一缺陷。flhDC是编码鞭毛生物合成的主要调节因子,调控了PGPR 在植物根表定殖过程中的运动和趋化, 参与了该过程中PGPR 生物膜的形成。此外,flhDC面临转录水平、mRNA 翻译水平、翻译后水平上的多重调控, 这在一定程度上解释了根际生防微生物制剂的迟效性和不稳定性, 同时也为提高PGPR 在植物根部的定殖效率提供理论指导。