全自动微生物流水线在临床微生物检验实习教学中的应用

覃卫娟 吴晓宁 梁正义 周利艳 韦欢欢 谢丽

临床微生物检验由于其知识体系涵盖基础、临床及预防医学等多学科范畴，涉及知识面广，临床实践性强，是教学工作的重点与难点[1]。近年来多重耐药菌的分离率不断攀升[2-3]，是临床抗感染治疗的热点和难点[4]，给临床微生物检验工作和教学实习带来新的挑战与机遇，同时对临床微生物工作人员和实习生提出了更高要求。以问题为基础的教学法（problem-based learning，PBL）起源于加拿大高等教育[5]，属于建构主义学习理论的领域，是一种以学生为中心，以问题为基础，教师引导的教学模式，通过临床实际案例的学习，激发学生学习的积极性和主动性，培养全面的临床思维，增强临床分析问题的能力。以案例为基础的教学法（case-based learning，CBL）基于典型案例，首先由教师提出具有代表性的临床案例，接着引导学员对案例进行积极讨论、分析，进而让学员对相关理论知识进行掌握[6]。大量研究表明PBL 教学可以提高学生的学习积极性和主动性、知识的吸收理解能力、学习效率等[7-9]；而CBL 教学可以明显提高临床思维技能、创新能力、团队合作、师生互动等[10-12]。临床微生物学检验知识比较繁琐复杂，相关知识更新快，学校所学知识滞后于临床应用，为了激发学生的学习热情，提高学习效果，将PBL 和CBL 教学法结合碧迪（Becton Dickinson，BD）Kiestra™WCA 全自动微生物流水线应用于临床微生物学检验实习教学中，同时培养学生的临床思维能力和科研能力。

1 BD Kiestra™ WCA 全自动微生物流水线工作原理与流程

临床微生物检验结果直接影响临床医生的诊断和治疗，BD 全自动微生物流水线可以为实习教学实践提供更直观的更深刻的体验，吸引学生兴趣，提高微生物实践的记忆力。流水线使用滚动珠技术，比基于环的条纹多产生3～5 倍的分离菌落，消除了人工变异性和对亚培养的需要，这可能会缩短病原体鉴定和抗菌药敏感实验，同时能提供更高效、更准确的检测结果，改善实验室工作流程，显著缩短检验周转时间（turn-around time，TAT）。BD Kiestra™WCA 微生物流水线由平板储存与分选模块、条码打印模块、接种划线模块、智能孵育箱模块组成。接种划线模块配备有2 级生物安全柜，可保护带教老师和学生的安全；临床液体样本，如血液、脑脊液、胸腹水、引流液、尿液、肺泡灌洗液，非液体标本，如痰液、粪便、分泌物、拭子等均可接种划线。接种后的平板通过轨道输送到孵育箱进行孵育，并按预设的时间节点进行拍照，整个过程通过平板的条码进行追踪和记录。智能孵育箱配备了平板影像系统，可按照用户自定义的时间点进行多次拍照，可记录平板上菌株的整个生长过程。根据光源和拍照模式的不同，可分别设置拍摄突出菌落和突出溶菌环的图片并保存。智能孵箱模块中的平板影像判读系统：平板影像系统与传统判读最大的区别在于可以设定不同的精确的孵育时间，并进行拍照影像保存，可实时观察菌落的生长情况；拍照过程中平板亦不需要反复从孵箱拿进拿出，通过阅板工作站的系统软件，可将生长平板的高清图片显示在屏幕上供实验人员判读，减少了开盖观察平板的生物安全风险，有报道微生物自动化流水线的应用使实验室生物安全管理及实验室医疗废物管理频率减少10%～20%[13]。对于阳性标本可直接在图片上进行标记后续鉴定、分纯、药敏试验、其他实验操作等。对于阴性平板，在培养程序结束后，将被自动移出孵育箱并分类堆叠到指定卡位。对于待查阅平板，可实现从孵箱自动输送到在线工作台。平板影像系统可以永久保存菌落的图像记录，学生随时查看各个历史培养结果，利于随时进行教学。总之，BD Kiestra™WCA 全自动微生物流水线随时可以进行平板判读，比较分析，更利于实习教学的展开。

2 临床微生物检验实习模式

临床微生物检验日常工作流程一般分为标本接收、编号、标本接种处理、涂片染色、阅片、血液培养、培养结果判读、细菌的分离鉴定、抗菌药物敏感试验、结果报告、医院感染监测等多个岗位，其中的重点、难点就是培养结果判读；同时临床微生物实验室日常工作量较大，学生实习周期有限，带教老师如何在有限的时间里把理论知识、操作技巧及相关领域前沿进展系统地讲解给学生，让学生领会掌握临床微生物检验相关知识和技能，培养学生学习的自觉性、临床思维和科研能力，是临床微生物检验实习教学重点需要破解的难题。

3 将BD Kiestra™ WCA 全自动微生物流水线融入临床微生物检验教学实习

实习生在临床微生物检验实习过程中会遇到各种各样的细菌、真菌、支原体等，许多病原菌在教材上并没有相关详细知识点，特别是病原菌耐药性快速增长以及未知病原体感染的问题。为了帮助学生在短暂的实习周内掌握相关临床微生物检验知识和技能，利用全自动微生物流水线平板影像系统拍照保存各种常见细菌、真菌、支原体以及各种常见病原菌少见表型、少见病原菌的生长过程，把拍照的生长过程图片作为基本的教学素材；通过PBL 和CBL 教学法，有目的地引导学生把专业知识、临床病症以及文献查阅相结合，激发学生学习的兴趣，通过对常见病原菌及少见菌进行分析研究，从而培养学生的逻辑思维能力、科研思维以及临床诊断思路分析的能力[14-15]，以达到高层次认知学习目标的目的。

3.1 各种常见病原菌的教学

临床上引起感染的常见革兰阴性杆菌有：大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、流感嗜血杆菌；革兰阴性球菌有：卡他莫拉菌、淋病奈瑟菌；革兰阳性球菌有：金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌等。多数情况下常见的病原菌在培养平板上的形态特征及生长特点和学生们在教材上认识的一致，易于分辨及鉴定，但是在临床工作中，经常遇到同一种细菌会有各种各样的表型，菌落特征甚至培养条件都与不一致。如同样是大肠埃希菌在同一个平板上可以有3 种甚至更多的菌落形态，尤其是尿液标本中最常遇到类似情况；如大肠埃希菌嗜二氧化碳型，生长需要CO2等[16]；这特殊情况在临床微生物检验过程中易发生误检、漏检等，给临床工作带来困难。利用全自动微生物流水线平板影像系统可以将各种病原菌常见表型和少见表型放在一起比较分析，如同时展示各种大肠埃希菌菌落形态：有β 溶血、无β 溶血，常规型、侏儒型菌落，粗糙干燥、光滑湿润，黏液型、非黏液型等，让学生加深理解，提高记忆，提高学生的学习兴趣。常见病原菌少见表型的鉴定及药敏试验，在教科书上甚至指南上没有专门论述，所以需要大量的查阅文献，并在实践中总结经验。例如，嗜二氧化碳大肠埃希菌的鉴定和抗菌药物敏感试验[17]，通过PBL 与CBL 教学相结合鼓励学生以病例为主线引导学生思考[18]：嗜二氧化碳的大肠埃希菌能否使用微生物全自动药敏分析仪进行药敏试验？嗜二氧化碳的大肠埃希菌产生的机制是什么？嗜二氧化碳的大肠埃希菌培养和药敏有什么特殊要求？通过这些问题引导学生查阅资料，了解该菌特点。带着问题出发，查阅文献资料，学生的学习主动性会增强，同时又提高了学生的临床思维和科研思维能力。

3.2 少见病原菌的教学

微生物检验工作中会时不时遇到各种少见病原菌，这些病原菌常常临床诊疗的关键所在，如何把这些可遇不可求的少见病原菌教授给学生是微生物实习教学的难点，通过微生物流水线平板影像系统保存的图片，可随时给学生进行展示学习，使少见病原菌变成“常见”，从而加深学生对少将病原菌的理解和认识。使用CBL 和PBL 教学法，让实习生对这些少见病原菌进行案例分析，即可培养学生的临床思维和科研能力。细菌、真菌会在血琼脂平板上生长形成肉眼可见的菌落，而支原体营养要求高，一般检测都是通过液体培养，教材上描述的人型支原体具有“油煎蛋”样菌落，日常工作中极少能见到，但是人型支原体在血琼脂平板上培养2～4 d 可见到细小透明的菌落生长[19]，通过全自动微生物流水线智能孵育箱中的平板影像系统，学生可看到支原体菌落特点和生长过程。如真菌培养，关于阿萨希毛孢子菌[20]的分类、培养特性、菌落特点、镜下形态，在教学中可提出问题：（1）棉兰染色在真菌鉴定中的意义？（2）阿萨希毛孢子菌鉴别要点有哪些、如何进行鉴定?（3）阿萨希毛孢子菌感染如何治疗？讲课围绕着标本的采集、阿萨希毛孢子菌的检验、抗菌药物敏感试验，生物学特性、感染特点和治疗过程等展开。同时讲解各种感染类型，让学生选择一种感染类型如血流感染、尿路感染、皮肤软组织感染等，查阅相关病历和文献，了解抗感染治疗过程；通过这些学生就会理解临床微生物检验的重要性，会对临床微生物检验感兴趣，增强职业责任感，从而培养学生的主动学习能力。学生通过对这种少见病原菌的学习，即掌握了阿萨希毛孢子菌的培养鉴别要点、生物安全意识和临床意义，同时也培养了学生的临床思维和科研思维能力，为今后参加临床工作打下基础。如关于脓肿分枝杆菌，指导学生针对全自动微生物流水线上保存有的脓肿分枝杆菌进行案例分析，查阅文献可知脓肿分枝杆菌是人类重要的致病菌，能够引起人类多种感染，如皮肤软组织脓肿[21]、肺脓肿[22]、毒血症[23]等，同时制作幻灯片并进行讲解，从而加深学生对非结核分枝杆菌的理解，同时又培养学生的临床思维和科研能力。

3.3 高致病性病原微生物的教学

在临床微生物检验日常工作和实习带教过程中，除了各种常见病原菌，还经常遇到各种高致病性细菌、真菌等，如何把这些可遇不可求的病原菌展示给学生让他们掌握，是每位微生物带教老师心中迫切需要解决的难题。少见珍贵的病原菌更希望能保存菌落生长过程、形态特点等，鉴于生物安全，少见的高致病性病原菌如：马尔尼菲蓝状菌、猪链球菌、布鲁氏菌等无法保存病原菌菌落，观察生长过程更无法实现，通过全自动微生物流水线智能孵育箱中的平板影像系统可以解决这些问题，平板在培养箱中孵育的同时即可拍照，不影响培养。可以设置平板影像系统拍照时间，每2、4、6、12、24 h 等更多时长拍照平板上的菌落，实时记录病原菌的生长过程，只要不结束平板在全自动微生物培养系统中培养，平板影像系统就可记录，1 周甚至更长的培养过程都可记录；如马尔尼菲篮状菌在沙氏培养基中24 h 一般肉眼无看不出产生酒红色色素，一般72 h 后才能见到，有些甚至需要4～5 d 后才能产生酒红色色素，这些特殊情况就微生物流水线平板影像系统就能记录下来。通过平板影像系统记录既可以保护教师和实习学生的安全，又不会错过这些少见病原菌的生长过程。

3.4 纸片扩散法抑菌圈测量的教学

纸片扩散法抑菌圈测量是微生物检验实习中的重要内容，不管如今的微生物自动化药敏分析仪器有多么先进，日常工作中的药敏始终需要用纸片扩散法来补充或复查才能发出满足临床需求，符合国家要求的药敏报告。抑菌圈测量有很多注意事项，在实习过程中虽然教师都和学生说了，但是没有实物展示给大家看，印象也就不深刻，有了微生物流水线就能解决这些问题。微生物流水线可以孵育并测量纸片扩散法的抑菌圈，并把测量图片保存下来，结合保存下来的图片就可以和学生说明纸片测量抑菌圈中的特殊情况，如：纸片扩散法中，抑菌圈内有菌落应检查纯度，纯度高的情况下量取时不应包括散在菌落；变形杆菌属的迁徙生长应忽略读取生长抑制区域；出现双圈若是细菌纯应量取内圈；复方新诺明抑菌圈量取可以忽略20%的细菌生长[24]；这些特殊的纸片结果日常工作中不是每天都能遇到，通过流水线测量抑菌圈并保存图片，学生可清晰地了解所谓的抑菌圈内散在菌落、双圈、变形杆菌属生长抑制区域等是怎么回事。

临床微生物室的工作多而繁杂，如何引导学生把基础理论知识与实践相结合，如何在实习中更有效地发挥基础知识，在短时间内内掌握临床微生物知识，是在教学设计过程中一直思考的问题。通过全自动微生物流水线把常见病原菌各种表型和各种少见病原菌进行总结分析应用于临床微生物实习教学，具有较强的代表性、启发性和可讨论性，有助于学生理解。在实习带教中，教师先讲解各种常见病原菌、常见病原菌少见表型和各种少见病原菌的培养、鉴定、药敏试验、临床意义；然后指导学生查阅文献及资料进行案例分析，结合患者临床资料及文献资料，探讨常见及少见病原菌的流行病学特点、耐药机制、致病机制、临床意义等，并提出培养要求特点、鉴别要点及药敏试验方案，并制作成幻灯片。

4 教学效果

4.1 学习兴趣提高，主动学习能力增强

在临床微生物学检验实习过程中，通过全自动微生物流水线把常见病原菌表型以及各种少见病原菌融入教学中，指导学生进行案例分析，能大幅度地提高学生学习临床微生物知识的主动性和学习兴趣。

4.2 基础理论知识理解加深，记忆升华

临床微生物检验实习是将在学校中学习到的理论知识转变成实践的过程，通过微生物流水线系统，声图并茂地对学生进行讲解、引导、提问，学生对理论基础知识的理解更深刻，记忆更长久，实现了质的升华。

4.3 临床思维和科研思维能力提高

临床微生物检验是和临床联系最紧密的专业，培养学生的临床思维和科研思维能力具有重要的意义。把各种常见病原菌和少见进病原菌引入教学可以同时培养学生实践操作技能和临床思维。少见病原菌和常见病原菌少见表型的培养鉴定、药敏试验和临床意义在教科书上甚至指南上没有专门论述，所以对少见表型菌株需要大量的查阅文献进行案例分析，并在实践中总结经验，这个过程中学生的临床思维和科研能力就会逐渐提高。

综上所述，在整个教学过程中，将CBL 联合PBL教学法结合全自动微生物流水线用于临床微生物实习教学，可将临床微生物检验、临床诊疗等知识有效地结合起来，拓宽学生的知识面。少见病原菌和常见病原菌少见表型容易被漏检或者误检，需要带教老师有深厚的专业知识，不断更新总结新知识，查阅文献，对少见病原菌的培养特性、鉴定、临床意义和抗菌药物敏感试验进行熟悉掌握；需要带教老师对临床微生物检验知识具有较高的洞察力、理解能力及热爱，从而激发学生学习兴趣。实习阶段是学生们将理论知识转化到临床实践的过渡阶段，通过全自动微生物流水线把少见病原菌和常见病原菌少见表型融入临床微生物检验实习教学中，能显著提高学生的学习兴趣和学习主动性，并能培养学生的临床思维和科研能力。常见病原菌和少见病原菌检验的临床微生物检验教学还需要不断地总结、实践、探索，从而形成更完善、科学的临床微生物检验实习教学模式。