ANO1抑制剂在AngⅡ诱导的VSMC增殖中的作用研究

于杰 姚刚 韩晓华 赵岚

1烟台市烟台山医院心血管内科，烟台 264000；2烟台市烟台山医院外科重症监护病房，烟台 264000；3青岛大学基础医学院生理教研室，青岛 266075

血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）是肾素-血管紧张素系统（RAS）的重要组成部分，存在于人体血管平滑肌、肾上腺皮质球状带细胞、心脏、肾脏及脑器官中，过度激活的RAS 可升高血管组织局部AngⅡ水平，诱导血管平滑肌细胞（VSMC）增殖、迁移、细胞外基质代谢紊乱，加速血管重构的形成、发展而升高血压，抑制VSMC增殖是防治高血压的重要环节［1-3］。钙激活氯通道参与多种细胞生理功能，如心肌细胞静息电位和动作电位形成、上皮细胞分泌、血管收缩、平滑肌收缩等，其中钙激活氯通道蛋白1（ANO1）主要存在于血管，在胸主动脉、脑动脉、肠系膜动脉、门静脉等均有分布［4-6］。ANO1 参与血管重构有较多报道，Lechartier 等［7］研究发现，ANO1 在肺动脉血管平滑肌高表达，通过促进VSMC 增殖、迁移参与肺动脉高压的形成、发展；也有研究结果显示，自发性高血压大鼠ANO1蛋白表达显著增加，应用ANO1抑制剂下调ANO1 蛋白表达后可舒张血管、降低血压［8］。但ANO1与高血压血管重构及ANO1抑制剂是否参与AngⅡ诱导的VSMC 增殖报道较少。鉴于此，本研究于2019 年7 月至2022 年6 月通过观察ANO1 抑制剂干预后对AngⅡ诱导正常大鼠胸主动脉VSMC增殖的影响，以期为ANO1抑制剂的临床应用及深入研发提供理论依据，现报道如下。

材料与方法

1.材料

1.1.细胞株 大鼠胸主动脉平滑肌细胞A7r5 细胞株，购于美国ATCC公司。

1.2.主要试剂与仪器 AngⅡ、ANO1 抑制剂（A01）、β-actin 抗体购于美国ApexBio 公司；DMEM 高糖培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购于美国Gibco 公司；一抗：EPK、AKT、CDK4、Cyclin D1，二抗：辣根过氧化物酶标记物购于美国Cell Signalin Technology 公司；磷酸缓冲液、多聚甲醛购于天津永大化学试剂开发中心；Hoechst 染色液、荧光淬灭剂购于上海碧云天生物技术有限公司，PMSE细胞裂解液购于北京康为世纪生物科技有限公司。CO2培养箱、培养瓶、培养板、细胞计数板购于美国Thermo Electron Corporation 公司，无菌工作台、倒置显微镜、ZT-Ⅱ型多头细胞样本收集器购于德国Carl Zeiss 公司，电泳仪、转膜仪、显影仪购于美国Bio Rad公司。

2.方法

2.1.细胞培养 大鼠胸主动脉平滑肌细胞A7r5 细胞株接种于含10%胎牛血清的DMEM 高糖培养基中，在37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养，静置使细胞充分贴壁，待细胞铺满瓶底90%时使用胰蛋白酶消化细胞使其成为单细胞悬液，以1∶3 的比例进行传代培养，取对数生长期的细胞进行后续试验。

2.2.Hoechst 33342 荧光染色观察ANO1 抑制剂干预后AngⅡ诱导的VSMC 形态学变化 取培养至对数生长期的VSMC，在细胞培养瓶中调整胞悬液使浓度为1×105个/ml，于96 孔细胞培养板中接种，每组均设置6 个复孔，于37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养24 h。分别加入10 nmol/L、100 nmol/L、500 nmol/L 浓度的A01，依次记为低剂量组、中剂量组、高剂量组，另取一组为对照组（等量生理盐水干预），均在37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下继续培养48 h，终止培养。弃去上清液后依次进行磷酸缓冲液洗涤、4%多聚甲醛固定、磷酸缓冲液再次洗涤、Hoechst 染色液染色，而后于每孔加入适量荧光淬灭剂并在荧光显微镜下观察。细胞凋亡率=凋亡细胞数量/总细胞数量×100%。

2.3.蛋白免疫印迹法检测ANO1抑制剂干预后AngⅡ诱导的VSMC 细胞凋亡相关蛋白的表达水平 分组及药物干预同2.2，采用磷酸缓冲液洗涤不同浓度A01 作用后的大鼠胸主动脉平滑肌细胞，加入PMSE细胞裂解液并提取各组总蛋白，依次上样、电泳、洗膜后加入1∶1 000 稀释的兔抗人EPK、AKT、CDK4、Cyclin D1（一抗）孵育，4 ℃摇床并过夜；采用磷酸缓冲液漂洗3 次后加入辣根过氧化物酶标记的二抗稀释液（1∶500），并进行ECL 化学发光，根据信号实际情况调整曝光时间，显影、定影后扫描胶片，与对应的β-actin条带光密度比值为EPK、AKT、CDK4、Cyclin D1 蛋白相对表达水平，重复3次，取平均值。

3.统计学分析

采用SPSS 26.0 统计学软件分析数据，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05 提示差异有统计学意义。

结果

1.ANO1抑制剂干预后AngⅡ诱导的VSMC形态学变化

Hoechst 33342 荧光染色结果显示，随着ANO1 抑制剂浓度增加，呈亮蓝色的细胞愈来愈多（染色质凝聚、出现凋亡小体），即细胞凋亡数量越多。低剂量组、中剂量组、高剂量组凋亡率分别为（17.60±1.36）%、（36.30±3.50）%、（61.25±6.33）%，均高于对照组凋亡率（4.32±0.51）%，组间差异均有统计学意义（均P＜0.05），即AngⅡ诱导的VSMC增殖后凋亡与ANO1抑制剂浓度之间存在剂量依赖性。见图1。

图1 ANO1抑制剂干预后AngⅡ诱导的VSMC形态学变化。A为对照组，B为低剂量组，C为中剂量组，D为高剂量组

2.ANO1 抑制剂干预后AngⅡ诱导的VSMC 凋亡相关蛋白表达水平

蛋白免疫印迹法检测ANO1 抑制剂干预后AngⅡ诱导的VSMC细胞凋亡相关蛋白结果显示，不同组间EPK、AKT、CDK4、Cyclin D1蛋白相对表达量主效应差异有统计学意义（P＜0.05）；与对照组比较，低剂量组、中剂量组、高剂量组EPK、AKT、CDK4、Cyclin D1 蛋白相对表达量均降低，且呈剂量依赖性，各组间差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表1、图2。

表1 ANO1抑制剂干预后AngⅡ诱导的VSMC细胞凋亡相关蛋白表达水平（）

注：ANO1 为钙激活氯通道蛋白1，AngⅡ为血管紧张素Ⅱ，VSMC 为血管平滑肌，A01 为ANO1 抑制剂。低剂量组、中剂量组、高剂量组分别加入10 nmol/L、100 nmol/L、500 nmol/L浓度的A01干预，对照组加入等量生理盐水干预。与对照组比较，aP＜0.05；与低剂量组比较，bP＜0.05；与中剂量组比较，cP＜0.05

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讨论

AngⅡ是血管重构过程中重要的血管活性物质，可激活EPK、AKT、MAPK 等多条信号通路，促进DNA、VSMC 蛋白合成及细胞迁移［9-10］。VSMC 异常增殖、迁移诱发的血管重构是高血压发病机制之一，而VSMC 又分为收缩型、合成型，其中收缩型VSMC 主要调节血管张力，血管活性物质、炎症因子、血流压力和剪切力改变均可促进VSMC 由收缩型转化为合成型，继而分泌大量细胞外基质，促进血管重构形成、发展［11-13］。本研究采用正常大鼠VSMC，探讨了ANO1 抑制剂干预后对AngⅡ诱导的VSMC 增殖作用的影响，结果显示：低剂量组、中剂量组、高剂量组凋亡率均高于对照组，即AngⅡ诱导的VSMC 增殖后凋亡与ANO1 抑制剂浓度之间存在剂量依赖性，提示ANO1 抑制剂可显著抑制AngⅡ诱导的VSMC增殖作用。

既往研究报道，ANO1胞内存在多个蛋白激酶磷酸化位点、胞外存在多个糖基化位点，不仅在细胞膜上发挥离子通道作用，还在细胞核膜或细胞器膜上同样具有离子通道功能，与细胞增殖密切相关，也可调节相关因子分泌［14-16］。本研究结果：ANO1 抑制剂可显著抑制AngⅡ诱导的VSMC 增殖作用，证实了ANO1 不仅参与血管舒张、收缩功能，还可能与各种血压升高、血管重构密切相关。也有学者在低氧诱导的大鼠肺动脉高压模型研究中发现，ANO1在肺动脉平滑肌细胞中高表达，且证实ANO1 是通过收缩血管、促进血管重构并参与肺动脉高压的形成［17］。临床可以ANO1 为作用靶点，进一步研究ANO1 抑制剂在血管重构诱发的不同疾病中的应用效果。激活EPK是细胞应对氧化应激时产生的保护反应；AKT是一种重要的抗凋亡因子，参与平滑肌细胞凋亡。本研究通过蛋白免疫印迹法检测ANO1 抑制剂干预后AngⅡ诱导的VSMC细胞凋亡相关蛋白结果显示，与对照组比较，低剂量组、中剂量组、高剂量组EPK、AKT 蛋白相对表达量均降低，且呈剂量依赖性，即ANO1 抑制剂干预后降低EPK、AKT 蛋白相对表达量意味着ANO1 抑制剂抑制AngⅡ诱导的VSMC增殖过程中，可能有EPK/AKT信号通路的参与。既往研究已发现ANO1 抑制剂可上调细胞周期负性调节蛋白，如p21、p27［18-19］。本研究进一步观察ANO1 抑制剂对细胞周期正性调节蛋白的影响，其中CDK4是细胞周期G 期重要的调控因子，特异性结合Cyclin D1 后形成的复合物可使Rb蛋白苏氨酸/丝氨酸残基磷酸化，刺激E2F基因转录，参与细胞增殖、迁移［20-21］，ANO1 抑制剂拮抗CDK4、Cyclin D1 蛋白表达意味着ANO1 抑制剂可能是通过抑制细胞周期进程而抑制VSMC增殖。

综上所述，ANO1 抑制剂可显著抑制AngⅡ诱导的VSMC 增殖作用，其机制可能与抑制EPK/AKT 信号通路及细胞周期进程有关。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明于杰：论文撰写，直接参与，工作支持；姚刚：直接参与；韩晓华、赵岚：工作支持