大蒜WRKY基因家族的鉴定与生物信息学分析

隋淑梅　黄思杰　田洁

摘要：WRKY转录因子参与调控植物的生长发育过程，是一类重要的转录因子。利用生物信息学方法从大蒜基因组中筛选并鉴定出63个WRKY家族基因，分析发现，大蒜WRKY基因家族成员均含有WRKY保守结构域，其编码产物的开放阅读框（ORF）为221～1 867 aa，氨基酸长度为73～621 aa，蛋白质相对分子量为8 594.72～67 991.64 u，等电点为4.91～9.86，氨基酸脂肪系数为41.14～76.28。其中，有35个AsWRKY蛋白是酸性蛋白，有28个AsWRKY蛋白是碱性蛋白，并且这63个家族成员都位于细胞核中。系统发育树将63个AsWRKY基因分成ClassⅠ、ClassⅡ和Group Ⅲ 三大类，第Ⅰ类有15个基因，第Ⅱ类有26个基因，第Ⅲ类有22个基因。分析保守结构域发现，同一类AsWRKY的结构域相似，所有成员都含有WRKYGQK七肽保守结构域和锌指结构，少数成员存在保守结构域变异。基因结构分析结果显示，AsWRKY基因的外显子数量为2～6 个，内含子数量为1～5个。基因相对表达量热图分析结果显示，AsWRKY基因家族成员在4个组织或器官中的表达量均不同，其中AsWRKY51、AsWRKY03在各组织中的相对表达量都最高。蛋白互作与基因共表达分析结果表明，AsWRKY55、AsWRKY15和AsWRKY24等处于网络中心位置，推测其积极响应盐、低磷、干旱等逆境胁迫。研究结果可为深入探究大蒜WRKY基因的功能及其调控植物生长发育的机制奠定基础。

关键词：大蒜；WRKY；基因家族；表达分析；生物信息学

中图分类号：S633.401 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2023）17-0041-11

大蒜［1］（Allium sativum L.）别称胡蒜，是石蒜科葱属一年生草本植物，具有强烈的辛辣蒜臭味，是一种食药两用型蔬菜。大蒜风味独特，富含有多种维生素、氨基酸和矿物元素等［2］，其鳞茎中含有的大蒜素具有抗菌、抗癌等药用价值，被认为是重要的天然保健食品［3］。近年来，大蒜的需求量日益增长，但是在实际生产过程中，大蒜常遭遇低温霜冻、干旱、病虫害等多种不利于大蒜生长发育的胁迫，因此研究大蒜响应逆境胁迫的基因具有重要意义。WRKY转录因子在植物生长发育和逆境响应中起着重要的调控作用［4］，WRKY家族成员一般含有非常保守的WRKYGKQ七肽序列和锌指基序CX4～5CX22～23HXHH （C2H2型）或CX7CX23HXC（C2HC型）［5］。因此，可将其分为3个组（GroupⅠ～Ⅲ），其中GroupⅠ含有2个WRKY结构域和C2H2锌指基序；GroupⅡ含有1个WRKY结构域和C2H2锌指基序，根据系统发育关系又可将GroupⅡ进一步分为5个亚组；Group Ⅲ含有1个WRKY结构域和C2HC锌指基序［6］。WRKY转录因子與靶基因启动子内的W-box顺式元件（T）TGAC（C/T） 结合，以此激活或抑制转录，进而调控下游基因的表达，在植物响应逆境胁迫时发挥重要的调控作用［7］。随着生物技术手段的成熟，有很多植物的WRKY基因家族被广泛研究，例如，拟南芥（Arabidopsis thaliana）［8］中有72个WRKY基因；大麦［9］（Hordeum vulgare）中有86个WRKY基因；玉米［10］（Zea mays）中有125个WRKY基因；在水稻［11］（Oryza sativa）中，粳稻中鉴定出 98 个 WRKY基因，籼稻中鉴定出 102 个WRKY基因。虽然大蒜基因组已经公布，但是对其WRKY 转录因子的相关研究较少。本研究基于大蒜全基因组数据库，对大蒜AsWRKY家族成员进行鉴定、生物信息学分析并对其在不同器官组织中的表达量进行分析，以期为初步阐明大蒜AsWRKY基因家族的功能提供参考。

1 材料与方法

1.1 大蒜AsWRKY基因家族成员的鉴定

从figshare网站（https：//doi.org/10.6084/m9.figshare.12570947.v1）上下载大蒜全基因组数据［12］，从pfam在线网站（http：//pfam.xfam.org/）下载获得WRKY保守结构域序列比对文件（PF03106）。利用TBtools软件，在BLAST界面下设定参数E值为10-5，Number of hits为1，用拟南芥WRKY家族的氨基酸序列来寻找可能的大蒜AsWRKY基因，初步获得大蒜AsWRKY候选基因序列后，在NCBI-CDD（https：//www．ncbi．nlm．nih．gov/guide/domains-structures/）中进行蛋白保守结构域的比对，手动删除不包含WRKY结构域的候选序列，接着利用SMART在线网站（http：//smart.embl-heidelberg.de/）分析候选基因编码的蛋白结构域，从而确定大蒜AsWRKY家族的成员数目。

1.2 大蒜AsWRKY基因家族的染色体定位与理化性质分析

使用TBtools软件从大蒜基因组gff文件中提取大蒜AsWRKY基因家族成员的染色体位置信息，并绘制染色体分布图，以基因在染色体上的位置进行命名（AsWRKY01～AsWRKY63）。

在ExPASy网站分析大蒜AsWRKY蛋白序列的分子质量及等电点等理化性质。用WoLF PSORT （https：//wolfpsort.hgc.jp/）进行大蒜WRKY蛋白的亚细胞定位预测。

1.3 大蒜AsWRKY基因家族系统发育及保守结构域分析

从TAIR官网下载拟南芥相关的蛋白序列。然后，利用MEGA软件，采用邻接法构建进化树，bootstrap重复次数为1 000次，对大蒜、拟南芥WRKY转录因子家族进行系统进化分析，从而确定大蒜WRKY转录因子家族的分类。用DNAMAN软件对大蒜、拟南芥WRKY蛋白序列进行多序列比对，并进行保守结构域的分析。

1.4 大蒜AsWRKY家族保守基序与基因结构的分析

利用MEME（http：//meme-suite.org/meme/tools/meme）在线工具对大蒜AsWRKY家族蛋白序列进行保守基序的分析，设置保守基序的数量为10个，记作基序1～基序10。用TBtools工具绘制大蒜AsWRKY基因结构。

1.5 大蒜AsWRKY基因家族的表达模式分析

从GEO数据库中下载Sun等于2020年上传的表达数据（登录号：GSE145455），提取大蒜WRKY家族基因在大蒜鳞茎膨大期（从鳞茎未膨大开始统计，每隔5 d取样1次，共8个时期）假茎（JJ）、根（G）、叶片（YP）的相对表达数据，用TBtools软件生成热图［12］。

1.6 大蒜AsWRKY基因家族蛋白互作與基因共表达分析

在String数据库中，以拟南芥作为植物参数，分析大蒜AsWRKY蛋白互作和基因的共表达模式。

2 结果与分析

2.1 大蒜WRKY家族基因染色体定位和蛋白理化性质分析

本研究从大蒜基因组中鉴定了63个AsWRKY基因，根据基因在染色体上的分布位置，依次将其命名为AsWRKY01～AsWRKY63。染色体定位分析结果（图1）显示，63个AsWRKY基因在8条染色体上均有分布，且分布不均匀；Chr2上分布得最多，有13个AsWRKY基因；Chr8次之，分布有11个AsWRKY基因；Chr7上分布得最少，只有2个AsWRKY基因；Chr1、Chr3上各分布6个AsWRKY基因；除此之外，Chr4、Chr5、Chr6上分别分布有4、7、8个AsWRKY基因。另外，聚集在Chr0上的AsWRKY58、AsWRKY59、AsWRKY60、AsWRKY61、AsWRKY62和AsWRKY63是未定位到Chr1～Chr8的染色体上的基因。

大蒜WRKY转录因子的理化性质分析结果（表1）表明，AsWRKY基因家族编码产物的ORF大小为221（AsWRKY56）～1 867aa（AsWRKY27）之间，氨基数量为73（AsWRKY56）～621 aa（AsWRKY27）；蛋白质相对分子量为8 594.72（AsWRKY56）～67 991.64 u（AsWRKY27）；等电点为4.91（AsWRKY10）～9.86（AsWRKY20），平均值为7.19，其中35个AsWRKY蛋白的等电点小于 7，是酸性蛋白质，有28个AsWRKY蛋白的等电点大于 7，是碱性蛋白质；氨基酸脂肪系数为41.14（AsWRKY02）～76.28（AsWRKY32）；AsWRKY01、AsWRKY08、AsWRKY11、AsWRKY17、AsWRKY53、AsWRKY55、AsWRKY56、AsWRKY58和AsWRKY60的不稳定指数均小于40，是稳定蛋白，约占AsWRKY家族的14%，其余蛋白属于不稳定蛋白。所有大蒜WRKY成员均定位于细胞核中，且平均亲水系数都为负数，说明该家族蛋白均为亲水蛋白。

2.2 AsWRKY家族成员系统进化树构建和AsWRKY蛋白保守结构域分析

对大蒜WRKY和拟南芥WRKY家族成员构建系统进化树，发现进化树可分为3个大类（图2）。其中，GroupⅠ包含15个AsWRKY成员，GroupⅡ组有26个AsWRKY成员，可继续分为5个亚组（GroupⅡ-a～GroupⅡ-e），分别有3、4、11、2、7个成员；剩下的22个AsWRKY成员被划分在Group Ⅲ。

蛋白保守结构域分析结果（图3）显示，AsWRKY结构域比较保守，但仍存在一些特异的变异，其中Group Ⅰ中的AsWRKY55保守结构域发生了缺失和突变，变为WTKN。GroupⅡ-a中的AsWRKY15保守位点的WRKYGQK变成了WLKYGQK，GroupⅡ-c中的AsWRKY08、AsWRKY29、AsWRKY30和AsWRKY31的保守位点的WRKYGQK变成了WRKYGKK。另外，AsWRKY56的保守位点的WRKYGQK变成了WTKYGKK；Group Ⅲ中的AsWRKY03、AsWRKY04、AsWRKY05、AsWRKY06、AsWRKY09、AsWRKY10、AsWRKY11、AsWRKY21、 AsWRKY36、AsWRKY47、AsWRKY49、AsWRKY60和AsWRKY62的保守位点WRKYGQK变成WRKYGEK。还有AsWRKY48的保守位点WRKYGQK变成WRKYAEK，推测这种变异可能产生了一些新的生物学功能。从锌指结构来看，63个蛋白都含有WRKYGQK和锌指结构2个保守结构域，除Group Ⅲ锌指结构类型为C2HC型之外，其余均为C2H2型。其中，GroupⅠ的C2H2型锌指基序为CX4C23HXH，GroupⅡ-a、GroupⅡ-b型锌指基序为CX6C29HXH；GroupⅡ-c的C2H2型锌指基序为CX4C23HXH；GroupⅡ-d、GroupⅡ-e的C2H2型锌指基序为CX5C23HXH；Group Ⅲ的C2HC型锌指基序CX7C23-HXC。另外，GroupⅡ-c中AsWRKY08、AsWRKY29和Group Ⅲ中AsWRKY07的锌指基序C2H2发生了丢失。此外，Group Ⅲ的锌指基序为C2HC，但AsWRKY39发生了变异，由原来的C2HC变异为C2H2（图3）。

2.3 大蒜WRKY保守基序分析与基因结构分析

在MEME在线网站设置10个保守基序，对63个大蒜WRKY蛋白进行分析。由图4可以看出，AsWRKY基因家族中有1～8个保守基序，GroupⅠ、Group Ⅱ和Group Ⅲ中基本都有Motif1（含有WRKYGQK基序）， 可以推测Motif1是AsWRKY基因家族的核心保守基序，但在Group Ⅱc中发现AsWRKY56蛋白中不存在WRKYGQK相关基序，可能是在遗传进化中发生了丢失。Group Ⅰ中有13个AsWRKY蛋白含有2个WRKYGXK基序，与Motif1一样，Motif3中也含有WRKYGXK基序，说明这2个保守基序的功能相似，但是其中的AsWRKY17、AsWRKY55蛋白没有Motif1、Motif3这2个保守基序，可能是在遗传进化中发生了丢失。Group Ⅱa、Group Ⅱd和Group Ⅱe中均只含有Motif 1、Motif 2 基序，说明这3个亚组中蛋白的功能高度相似。

很多AsWRKY家族成员都含有Motif 1、Motif 2，在Group Ⅰ、Group Ⅱ中，除个别蛋白外，其他蛋白都含有Motif 1、Motif 2基序。另外，Group Ⅲ中有5个蛋白也含有Motif 1、Motif 2基序。然而，有一部分motif仅在某一类别中出现，如Motif 6、Motif 10仅在Group Ⅲ中存在，Motif 3、Motif 4、Motif 7、Motif 8、Motif 9只在Group Ⅰ中存在。上述结果表明，同一类型的AsWRKY含有的保守基序相似，但是不同类型的AsWRKY中含有的保守基序不同，推测某一特定基序可能在不同类型的AsWRKY家族成员中发挥特定作用。

由图5可以看出，AsWRKY基因的外顯子、内显子数分别为2～6、1～5个，63个AsWRKY基因都没有非编码区。在GroupⅠ中，AsWRKY18、AsWRKY27的外显子和内含子数最多，各有6个外显子、5个内含子；AsWRKY28、AsWRKY33和AsWRKY02有5个外显子、4个内含子；AsWRKY17有3个外显子、2个内含子；AsWRKY55有2个外显子、1[CM（21*5]个内含子，其外显子、内含子数目最少。除此之外，其他基因均只含有4个外显子、3个内含子。在Group Ⅱa中，仅含有1～2个外显子，其中只有AsWRKY15含有1个内含子；在Group Ⅱb中，除AsWRKY40含有6个外显子外，其余成员均含有5个外显子；Group Ⅱc中有2～5个外显子，其中AsWRKY29有5个外显子，其外显子数目最多，AsWRKY58、AsWRKY53、AsWRKY56和AsWRKY08只有2个外显子，数目最少；在Group Ⅱe中，除AsWRKY54仅含有2个外显子之外，其他成员均含有3个外显子；在Group Ⅱd的2个成员中，AsWRKY20含有3个外显子，AsWRKY23含有2个外显子。Group Ⅲ中的AsWRKY35包含6个外显子、5个内含子，其外显子、内含子数目最多；AsWRKY22有2个外显子、1个内含子，其外显子、内含子数目最少；AsWRKY49、AsWRKY62有4个外显子、3个内含子。除此之外，其他基因均只含有3个外显子、2个内含子。总之，AsWRKY保守基序和外显子的差异会导致其基因结构和功能的差异。

2.5 大蒜WRKY基因在不同器官中的表达模式分析

63个大蒜WRKY基因在不同组织（鳞茎、根、叶片和假茎）中的表达模式分析结果见图6。可以看出，63个AsWRKY基因中除AsWRKY50、AsWRKY22、AsWRKY33、AsWRKY02和AsWRKY04在大蒜不同组织中不表达外，其他基因在大蒜不同组织中表现出不同程度的上调表达，其中AsWRKY51、AsWRKY03在各组织中的相对表达量都最高，而AsWRKY03的相对表达量在鳞茎膨大的前4个时期尤为显著；AsWRKY01、AsWRKY42和AsWRKY48在各个组织中的相对表达量都很高，但AsWRKY01在LJ1中的相对表达量与其他组织相比略低，而AsWRKY42、AsWRKY48在根中的相对表达量与其他组织相比略低；AsWRKY47、AsWRKY55、AsWRKY06和AsWRKY46在各个组织中的相对表达量都较高，但AsWRKY47在叶片中的相对表达量与其他组织相比略低，AsWRKY06、AsWRKY46在叶片中的相对表达量与其他组织相比略低；AsWRKY23、AsWRKY32、AsWRKY52、AsWRKY07和AsWRKY20在各个组织中的相对表达量较低；AsWRKY26、AsWRKY24、AsWRKY40、AsWRKY43、AsWRKY38、AsWRKY08和AsWRKY28的相对表达量较低，其中AsWRKY24、AsWRKY40、AsWRKY43和AsWRKY38在根中不表达；AsWRKY10、AsWRKY54除在鳞茎中不表达外，在其他组织中均有表达；AsWRKY59仅在LJ8中表达。

2.6 大蒜WRKY蛋白互作与基因共表达分析

在String蛋白互作数据库中，以拟南芥为参数，进行大蒜WRKY蛋白互作及基因共表达分析（图7）。由图7-A可见，AsWRKY11、AsWRKY23、AsWRKY15、AsWRKY37、AsWRKY44、AsWRKY39、AsWRKY55、AsWRKY18、AsWRKY34、AsWRKY22、AsWRKY36、AsWRKY62、AsWRKY24、AsWRKY58、AsWRKY08、AsWRKY57、AsWRKY27和AsWRKY28共18个蛋白参与互作。其中，AsWRKY55、 AsWRKY15和AsWRKY24处于网络中心位置，彼此间存在较强的相互作用，其余蛋白间也存在或强或弱的相互作用，其中线条越多，表明互作强度越强，线条越少，表明互作强度越弱。AsWRKY共表达结果（图7-B）显示，一些基因间发生了共表达，颜色越深则表明表达水平越高；AsWRKY39、AsWRKY22、AsWRKY55、AsWRKY62和AsWRKY36等基因的共表达水平较高，其中AsWRKY55和MPK3、AsWRKY55和AsWRKY15、 AsWRKY55和AsWRKY22、 AsWRKY62和AsWRKY36间的共表达水平明显高于其他成员。

3 讨论与结论

WRKY是植物体内含有的一种独特的转录因子，参与调控植物的生长发育，同时在植物受到外界环境逆境胁迫时，会做出相应应答［6，13-15］。本研究从大蒜基因组数据中鉴定了63个AsWRKY家族成员，与桃中PpWRKY数量（61个）［16］相近，但比拟南芥（72个）［8］、水稻（102个）［11］、小麦（270个）［17］、大麦（98个）［18］少。本研究通过与拟南芥构建系统进化发育树，将大蒜AsWRKY家族分成3个亚家族（Ⅰ亚家族、Ⅱ亚家族和Ⅲ亚家族），Ⅱ亚家族进一步分成Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd和Ⅱe，这种分类方式与其他研究结果［5，19-20］一致。染色体定位结果显示，基因在8条染色体上呈不均匀分布，其中Chr2上分布得最多，有13个大蒜AsWRKY基因，Chr7上分布得最少，只有2个AsWRKY基因。另外，还有AsWRKY58、AsWRKY59、AsWRKY60、AsWRKY61、AsWRKY62和AsWRKY63这6个基因未定位到染色体上，聚集在0Chr上，而在甜瓜数据库中，0Chr也同样是指无法定位到染色体上的片段［21］。

保守结构域分析结果显示，大多数AsWRKY结构域比较保守，但存在部分蛋白保守结构域发生了变异，WRKYGQK变异的类型有WTKN、WLKYGQK、WRKYGKK、WTKYGKK、WRKYGEK和WRKYAEK，推测这种变异可能产生了一些新的生物学功能，这与香樟蛋白序列比对的结果相似［22］。其中，部分大蒜WRKY蛋白保守结构域发生的变异与山苍子［23］WRKY蛋白（保守结构域WRKYGQK变异为WRKYGKK）和秋茄［24］WRKY蛋白（KcWRKY14、KcWRKY27这2个WRKY家族成员的核心结构域分别分别变异为WRKYGEK、WRKYGKK）保守结构域发生的变异相似，但是大蒜蛋白的保守结构域发生变异的类型较多。

保守基序和基因结构结果表明，AsWRKY基因家族的保守基序有1～8个，GroupⅠ、Group Ⅱ和Group Ⅲ中基本同时含有Motif1（含有WRKYGQK基序），可以推测Motif1是AsWRKY基因家族特有的保守基序。而 Group Ⅱa、Group Ⅱd和Group Ⅱe中均只含有Motif1、Motif2，说明这3个亚组中蛋白的功能十分相似，这与枣中有相同motif的基因、功能相同的结论［25］一致。另外，AsWRKY的外显子数量为2～6 个。由此推测AsWRKY基因功能差异是由上述两者导致的［26］。

AsWRKY基因表达热图分析结果表明，63个AsWRKY基因中，除AsWRKY50、AsWRKY22、AsWRKY33、AsWRKY02和AsWRKY04这5个基因在大蒜不同组织中不表达之外，其他基因在大蒜不同组织中表现出不同程度的上调表达，其中AsWRKY51、AsWRKY03在各组織中的相对表达量都最高，且AsWRKY03在 LJ-1、LJ-2、LJ-3和LJ-4中相对表达量最高；AsWRKY10、AsWRKY54只在根、假茎和叶片中表达，且AsWRKY54在G中的相对表达量最高；AsWRKY59仅在LJ8中表达。在本研究中，大蒜AsWRKY在不同器官中的相对表达量与大蒜WOX基因［27］在不同器官中的相对表达量差异较大且不相同，这说明不同基因在同一物种、同一器官和组织中的相对表达量差异较大。

大蒜蛋白互作结果表明，AsWRKY55、AsWRKY15和AsWRKY24蛋白处于网络中心位置，彼此间存在较强的相互作用，在整个WRKY调控过程中起关键作用［28］。另外，本研究中AsWRKY55的同源蛋白是AtWRKY33，AsWRKY15的同源蛋白是AtWRKY40，AsWRKY 24的同源蛋白是AtWRKY6。有研究表明，拟南芥植株耐盐性的提高可诱导AtWRKY33基因过量表达［29］，AtWRKY40蛋白可能参与植物干旱胁迫响应过程［30］，AtWRKY6蛋白响应拟南芥低磷逆境胁迫，并调控该过程［31］。因此推测，AsWRKY55、AsWRKY15和AsWRKY24蛋白也可能存在与拟南芥同源蛋白类似的功能。

本研究基于大蒜全基因组数据，初步挖掘了大蒜WRKY家族转录因子的基本信息，可为进一步探讨大蒜响应逆境胁迫机制、挖掘关键基因和功能提供一定理论依据。

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收稿日期：2022-12-21

基金项目：国家自然科学基金（编号：31960590）；青海省科技厅重点实验室项目（编号：2022-ZJ-YO1）；青海省科协中青年科技人才托举工程（编号：2021QHSKXRCTJ01）。

作者簡介：隋淑梅（1998—），女，青海海东人，硕士，主要从事蔬菜生理方面的研究。E-mail：1577983588@qq.com。

通信作者：黄思杰，农艺师，主要从事生态农业栽培技术方面的研究，E-mail：hsjofrcc@126.com；田 洁，博士，研究员，主要从事园艺蔬菜生理术研究，E-mail：tiantian8092001@163.com。