丛枝菌根真菌对镉胁迫小麦褪黑素代谢的调节作用

韩蕾蕾　张乐乐　王慧娟　腾慧鑫　袁祖丽

摘要：为研究丛枝菌根真菌（AMF）是否通过对镉（Cd）胁迫小麦褪黑素（MLT）代謝的调节作用来增强小麦Cd耐性，以小麦和摩西球囊霉为试验材料，采用土培方法，研究Cd胁迫下接种AMF对小麦MLT代谢的调节作用。结果显示，Cd胁迫下接种AMF处理与同浓度Cd胁迫处理相比，小麦叶片5-羟色胺（5-HT）、5-甲氧基色胺（5-MT）、MLT及2-羟基褪黑素（2-HMT）含量均有不同程度的增加，MLT合成相关酶及分解相关酶的活性均有不同程度的提高，MLT的合成酶基因TaASMT1、TaASMT2、TaCOMT、TaSNAT及MLT的分解基因Ta2-ODD的表达水平均有不同程度上调。表明AMF可以通过上调Cd胁迫小麦内源MLT代谢相关基因表达水平来提高相应酶的活性，促进MLT的合成，同时加速MLT分解为2-HMT，缓解Cd胁迫造成的氧化伤害，增强小麦的Cd耐性。

关键词：褪黑素；镉；丛枝菌根真菌；小麦；抗氧化

中图分类号：S512.101 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2023）17-0059-08

近年来，随着污水灌溉、农药以及肥料的过度应用和人为因素，土壤重金属污染日趋严重化［1］。据报道，我国耕地土壤重金属污染面积约占全国总耕地面积的1/6［2］，其中40%以上的耕地土壤被镉（Cd）污染［3］。Cd可长期存在于土壤中，不可降解，是植物的非必需元素，也是毒性最强的元素之一。Cd易被植物根系吸收，转运到植物各器官，进入植物细胞的Cd可引起活性氧（ROS）暴发［4］。过量的ROS破坏蛋白质、核酸及细胞器结构，造成膜质过氧化，干扰细胞的正常代谢［5］。植物通过复杂的代谢网络和转录调控，主要通过抗氧化酶系统［主要有超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）等］和抗氧化剂系统等代谢通路相关的基因表达、信号转导和代谢产物的合成，调节细胞维持适当水平的ROS，保护自身免受氧化损害，从而实现合适的生理、生化过程。抗氧化剂系统主要有谷胱甘肽（GSH）、抗坏血酸（AsA）、类黄酮、花青素、类胡萝卜素和酚类等［6-7］。

褪黑素（MLT）遍布于植物所有器官中，是一种公认的多效性分子，参与植物的生长、发育和应对各种非生物胁迫，特别是重金属胁迫［8-9］。MLT具有亲水和亲脂的两性特点，易穿过细胞膜［10］，是目前已知的抗氧化性最强的内源性ROS自由基清除剂［11］。MLT不仅直接清除小麦中Cd胁迫产生的过量ROS，维持细胞低浓度ROS水平［12-13］，而且间接清除ROS。MLT生物代谢过程中产生了N1-乙酰-N2-甲酸基5-甲氧基糖胺（AFMK）以及2-羟基褪黑素（2-HMT）等大量代谢物，也是增强细胞抗氧化能力的高效抗氧化剂，进一步增强细胞的抗氧化能力［14］。MLT还能增加类胡萝卜素、脯氨酸、类黄酮、花青素的含量，以应对Cd诱导的氧化应激［15-17］。此外，MLT在许多生理过程中会诱导基因表达［18-19］。外源MLT还可通过调节氧化还原酶SOD、POD 、CAT等的活性，提高AsA、GSH等抗氧化剂的含量，清除因胁迫造成的过量ROS，从而缓解逆境胁迫对植物造成的氧化损伤［12-13］。

MLT 是来自于5-羟色氨的惰性化合物。大量研究显示，植物中合成MLT的前体物质均为色氨酸，色氨酸经4个连续的酶促反应生成MLT。色氨酸脱羧酶（TDC）催化生成色胺酸，之后由色胺-5-羟化酶（T5H）催化色胺转变为5-羟色胺（5-HT）、5-羟色胺-甲基转移酶（ASMT）或咖啡酸-O-甲基转移酶（COMT）催化5-HT形成5-甲氧基色胺（5-MT），5-MT由5-羟色胺-N-乙酰基转移酶（SNAT）催化生成MLT，MLT经由褪黑素-2-羟基酶（M2H）催化分解为2-羟基褪黑素（2-HMT）［20-21］。M2H基因属于2-氧戊二酸依赖性双加氧酶（2-ODD）家族，且M2H本身也是一种诱导防御基因表达的重要信号分子［22］。Byeon等的研究表明，2-ODD基因以不同程度的催化活性催化MLT向2-HMT转化［23］。

丛枝菌根真菌（AMF）是一种分布极为广泛的内生型菌根真菌，能与陆地生态系统中约90%的高等植物共生形成菌根［24］。AMF不仅能改善土壤质量，且在胁迫条件下可赋予植物抗逆性［25］。因此，菌根化是植物解除重金属毒性和增强重金属耐性的一个重要途径［26］。一方面，AMF可通过减少土壤中Cd的生物可用性、减少植物中Cd含量、增强叶片抗氧化酶活性、增加抗氧化剂含量及植物螯合素含量等缓解植物Cd毒性［27-28］；另一方面，AMF可诱导Cd胁迫下宿主植物基因的表达［29］，改变各种生理和生化途径，调节宿主植物体内信号物质，如过氧化氢（H2O2）、植物激素等提高非生物胁迫条件下宿主植物的抗逆性［30］。

小麦是人类的主食之一，其种植面积约占我国粮食作物总面积的30%［31］，但由于人类的活动导致土壤重金属污染日趋严重，部分地区土壤Cd含量超标，严重影响小麦的生长发育及产量、品质。据报道，河南新乡的小麦被曝出重金属Cd含量超标1.7～12.8倍［32］。因此，迫切需要开发不影响农田耕作、可持续的原位修复技术。前期研究表明，AMF可减少小麦根系吸收Cd，增强叶片抗氧化酶活性，提高抗氧化剂含量，缓解Cd毒性，促进小麦生长发育。然而，AMF是否通过调节MLT代谢通路增强Cd胁迫小麦的抗氧化能力尚未见报道。本试验以小麦和AMF为研究材料，研究AMF对Cd胁迫小麦MLT代谢的影响，为Cd污染土壤小麦栽培的原位修复奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

小麦（Triticum aestivum L.）品种为百农207，由河南农业大学国家小麦工程技术研究中心提供，AMF为摩西球囊霉菌（Glomus mosseae）接种物，由北京市农林科学院植物营养与资源研究所提供，接种物包括真菌的菌丝、孢子和培养基质。

1.2 试验方法

本试验于2020年7月5日至2021年3月26日在河南省郑州市河南农业大学推广楼进行，共设6个处理，Cd胁迫浓度分别设计为5、10 mg/kg，试验设计如表1所示。

采用土培的试验方法，营养土按基质 ∶蛭石=3 ∶1 的体积比混合，拌匀，高温高压（121 ℃、103 kPa）灭菌30 min。杯子用75%乙醇消毒，小麦种子用100 mL 3% H2O2浸泡消毒。在未接菌杯子中加入营养土115 g、灭活菌种 5 g，在接菌杯子装入营养土115 g、菌种5 g。每杯播种30粒种子并放置于光照培养箱中，培养条件为16 h（光照）/8 h（黑暗），温度16～25 ℃，相对湿度80%，光照度0～100 μmol/（m2·s），每个处理重复3次。

播种4 d后全部出土发芽，按试验设计对小麦幼苗进行Cd胁迫处理（将CdCl2·2.5H2O一次性溶解到50 mL的Hoagland＇s营养液中浇灌，以纯Cd计）。幼苗每2 d浇灌未含Cd的Hoagland＇s营养液维持营养土的湿度为80%。幼苗长至 21 d（2叶1心）時，收取小麦叶片，-80°C保存备用。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 生物量 在小麦镉胁迫后5、10、15 d，分别随机选取5株完整的小麦植株进行冲洗，吸干小麦植株表面的水分后，测其鲜质量，之后将6个处理组的小麦苗分别放入纸袋置于烘箱中，于 80 ℃烘干72 h，测定其干质量。

1.3.2 H2O2及丙二醛（MDA）含量测定 用硫代巴比妥酸（TBA）显色法测定MDA含量。取0.1 g叶片加入2 mL 10%三氯乙酸（TCA）溶液中，用液氮研磨成匀浆，少量多次清洗研钵后倒入离心管，4 000 r/min，4 ℃离心10 min，此时上清液即为提取液。取0.4 mL提取液于试管中，加入 0.4 mL 0.6% TBA溶液，混匀后100 ℃反应15 min，再迅速放入冰浴中，8 000 r/min，常温离心10 min。酶标仪预热30 min并测定各样本在532、600、450 nm波长处的吸光度，并计算MDA 含量。MDA 含量=5×［12.9×（D532 nm-D600 nm）-1.12×D450 nm］/m，式中：D表示吸光度，m表示鲜质量。

H2O2含量的测定使用Solarbio试剂盒，试验过程按说明书操作，试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3.3 5-HT、5-MT、MLT及2-HMT含量测定 5-HT、5-MT 、MLT及2-HMT含量采用上海酶联生物科技有限公司的酶联免疫试剂盒检测，试验步骤按试剂盒说明书操作。

1.3.4 SNAT、COMT、ASMT及M2H活性测定 SNAT、COMT、ASMT及M2H的活性采用上海酶联生物科技有限公司的酶联免疫试剂盒检测，试验步骤按试剂盒说明书操作。

1.3.5 SNAT、COMT、ASMT及M2H相关基因表达水平分析 使用Primier 5. 0软件设计特异性引物，内参基因是TaActin基因特异性引物TaSNAT参照Ke等的研究［33］进行选择。每个样品重复3次，取平均值后采用2-ΔΔCT法计算。运用DPSv 14.10进行显著性差异分析。

1.4 数据统计分析

用Excel 2013进行初步的数据处理分析，用DPS 14.10数据处理软件进行最小显著差异法（LSD）单因素方差分析，用Origion 2018作图。

2 结果与分析

2.1 AMF对Cd胁迫小麦生物量的影响

由表3可知，与CK相比，小麦的鲜质量和干质量随Cd胁迫浓度的升高而降低，且与胁迫浓度呈负相关关系。5、10 mg/kg Cd胁迫接种AMF处理与同浓度Cd胁迫处理相比，小麦的鲜质量与干质量均明显增加，多数处理差异显著（P<0.05），表明接种AMF可以缓解Cd胁迫带来的伤害，促进小麦生长。

2.2 AMF对Cd胁迫小麦H2O2及MDA含量的影响

由图1可知，与CK相比，Cd胁迫使H2O2及MDA含量均显著提高。5、10 mg/kg Cd胁迫下，H2O2含量与CK相比分别显著提高了26.32%、59.39%，MDA含量与CK相比分别显著提高了15.59%、28.06%，且H2O2及MDA含量均与Cd胁迫浓度呈正相关关系。5、10 mg/kg Cd胁迫接种AMF处理与同浓度Cd胁迫处理相比，H2O2含量分别显著降低了22.90%、42.84%，MDA含量分别显著下降了6.66%、9.74% 。结果表明，小麦体内ROS含量随着Cd浓度的增加而增加，小麦氧化伤害加剧，而接种AMF能缓解Cd胁迫带来的氧化伤害。

2.3 AMF对Cd胁迫小麦5-HT、5-MT、MLT及 2-HMT 含量的影响

5-HT是合成5-MT的底物，而5-MT是合成MLT的前身物质。MLT和2-HMT均为有效的抗氧化剂［14］。由图2可知，Cd胁迫显著提高了 5-HT 和5-MT 的含量。与CK相比，5、10 mg/kg Cd胁迫下，5-HT的含量分别显著增加25.79%、23.18%，5-MT的含量分别显著增加29.31%和31.07%。5 mg/kg Cd胁迫接种AMF处理与同浓度 Cd胁迫处理相比，5-HT含量显著增加14.13%，表明5 mg/kg Cd胁迫接种AMF促进5-HT合成。但10 mg/kg Cd胁迫接种AMF处理与同浓度 Cd胁迫处理相比，5-HT含量虽然增加但差异不显著。说明10 mg/kg Cd胁迫下AMF对5-HT合成的促进效应减小。

由图2可知，5、10 mg/kg Cd胁迫下，MLT含量比CK分别显著增加21.11%和20.55%，2-HMT含量比对照分别显著提高14.03%和11.15%，说明Cd胁迫下小麦可通过提高MLT和2-HMT的含量增加抗氧化能力。5 mg/kg Cd胁迫接种AMF处理与同浓度 Cd胁迫处理相比，MLT含量显著增加19.54%，2-HMT含量显著上升18.33%；但10 mg/kg Cd胁迫接种AMF处理与10 mg/kg Cd胁迫处理相比，MLT及2-HMT的含量虽然有所上升但差异不显著，表明5 mg/kg Cd胁迫下接种AMF有助于大幅提高小麦的抗氧化能力，10 mg/kg Cd胁迫下AMF对MLT和2-HMT合成促进的效应下降。

2.4 AMF对Cd胁迫小麦ASMT、COMT、SNAT及M2H活性的影响

ASMT和COMT催化5-HT合成为5-MT，SNAT催化5-MT合成为MLT，MLT 由M2H催化分解为2-HMT。由图3可知，与CK相比，5 mg/kg Cd胁迫下，ASMT活性显著提高43.34%，而 10 mg/kg Cd胁迫下ASMT活性虽然有所增加，但与CK相比差异不显著；而COMT活性分别显著增加38.56%和35.12%，SNAT活性分别显著上升46.43%和34.32%，M2H活性分别显著上升27.92%和18.14%，表明Cd胁迫促进小麦SNAT、COMT、ASMT及M2H活性增加。5、10 mg/kg Cd胁迫接种AMF处理与同浓度Cd胁迫处理相比，ASMT活性分别提高9.42%和30.84%，COMT活性分别显著提高13.04%和22.42%，SNAT活性分别显著提高24.02%和34.79%，M2H活性分别显著提高11.14%和16.63%。接种AMF能提高Cd胁迫下小麦ASMT、COMT、SNAT及M2H的活性，促进MLT和2-HMT的合成。

2.5 AMF对Cd胁迫小麦叶片MLT代谢相关基因表达水平的影响

TaASMT是催化5-HT形成5-MT的基因。由圖4-A可知，TaASMT1在Cd胁迫下表达上调。与CK相比，TaASMT1表达水平在5、10 mg/kg Cd胁迫下分别上调228.07%和97.90%。5、10 mg/kg Cd胁迫下接种AMF处理与同浓度Cd胁迫处理相比，TaASMT1表达分别显著上调79.10%和144.62%，说明Cd胁迫促进小麦TaASMT1基因表达，Cd胁迫接种AMF进一步提高TaASMT1表达。由图 5-B 可知，Cd胁迫下TaASMT2的表达水平分别上调54.53%和31.22%，但与CK相比差异不显著。5、10 mg/kg Cd胁迫下接种AMF处理与同浓度Cd胁迫处理相比，TaASMT2的表达水平分别显著上调394.67%和250.11%，表明Cd胁迫小麦接种AMF可显著上调TaASMT2的表达水平。可见，接种AMF 有助于提高ASMT活性，促进 5-HT 合成为 5-MT。

TaCOMT也是催化5-HT形成5-MT的基因。由图4-C可知，与CK相比，5、10 mg/kg Cd胁迫下，TaCOMT的表达水平分别上调104.81%和100.77%。5、10 mg/kg Cd胁迫接种AMF处理的TaCOMT表达水平比同浓度Cd胁迫处理分别上调80.18%和39.26%，其中5 mg/kg Cd胁迫接种AMF处理的TaCOMT表达显著上调。表明低浓度Cd胁迫接种AMF可以显著提高Cd胁迫小麦TaCOMT的表达水平。

TaSNAT是催化5-MT形成MLT的基因。由图4-D可知，与CK相比，5、10 mg/kg Cd胁迫下，小麦TaSNAT的表达水平上调25.48%、11.45%，但差异不显著。5、10 mg/kg Cd胁迫小麦接种AMF后，小麦TaSNAT表达水平比同浓度Cd胁迫处理上调13.22%、10.07%，但差异不显著，表明Cd胁迫接菌对小麦TaSNAT的表达水平影响不显著。

M2H是分解MLT成为2-HMT的酶，且M2H本身也可充当一种诱导防御基因表达的信号分子，M2H基因属于Ta2-ODD家族［22-23］。由图4-E可知，5 mg/kg Cd胁迫处理Ta2-ODD基因表达水平显著上调86.09%，10 mg/kg Cd胁迫处理 Ta2-ODD 基因表达上调但与CK相比差异不显著。5、10 mg/kg Cd胁迫接种AMF处理与同浓度Cd胁迫处理相比，Ta2-ODD表达水平分别显著上调72.03%、87.52%，说明Cd胁迫小麦接种AMF可显著上调Ta2-ODD的表达水平。

3 讨论与结论

研究表明，进入小麦细胞的Cd通过诱导H2O2等ROS的积累引起氧化胁迫，造成细胞膜脂过氧化，同时Cd胁迫还影响光合效率、叶绿素和矿物元素含量，从而抑制小麦植株的生长［13，33］。外源MLT可通过控制ROS水平并激活抗氧化反应，减小重金属的毒性。Li等发现，MLT通过减少小麦ROS的产生，增加AsA和GSH的含量，并增加鲜质量、干质量以及叶绿素含量，减轻小麦Cd毒性［12］；Ma等研究发现，外源MLT激活了Cd胁迫玉米抗氧化物防御系统（即SOD、POD、CAT），改善了植物生物量和幼苗生长［34］；Sami等研究发现，MLT可以减少Cd 胁迫油菜的ROS积累，降低H2O2水平［16］。

AMF可以提供许多不同的农业生态系统服务，如有效利用土壤养分、防止生物和非生物胁迫并改善土壤。AMF侵染可诱导植物发生重要的形态和功能变化。近年来，关于AMF侵染对植物分子反应的影响研究越来越多。首先，AMF可以增强作物抗氧化能力。很多研究表明，接种AMF可增强非生物胁迫下玉米、旱稻、小麦等作物的抗氧化酶活性［26，35-36］。其次，AMF可以调节寄主植物内源激素水平。He等的研究表明，AMF 接种改变了植物叶片植物激素如赤霉素（GA）、玉米素核糖（ZR）和茉莉酸（JA）等的浓度和比例［37］。最后，AMF可以调节寄主植物基因的表达。Campos等报道AMF 诱导小麦根系与氧化应激和金属离子结合相关的基因表达［38］。Chen等研究发现，AMF接种提高了洋槐抗氧化酶编码基因的表达水平，以增加抗坏血酸浓度［39］。此外，接种AMF会影响Cd胁迫下寄主植物吸收和转运Cd相关基因的表达。例如，在Cd胁迫下接种AMF后，大豆中GmHMA19的表达量上调，从而降低了植物中Cd的含量和毒性［40］；AMF与旱稻共生降低了旱稻根系Nramp5的表达量和Cd的浓度，但增加了HMA3的表达量［41］。

Sun等研究发现，COMT1过表达显著提高了植株MLT含量［42-43］；Wang 等研究发现，SNAT在拟南芥中的异位表达增加了内源性MLT的水平［44］。Byeon等研究发现，2-ODD的转录水平提高了水稻中M2H活性［45］。Yu等研究发现，SNAT和ASMT的过表达，提高了MLT的含量，减少了植物中Cd的积累，赋予植物 Cd耐受性［46-47］。在本研究中，5、10 mg/kg Cd胁迫接种AMF处理与同浓度Cd胁迫处理相比，小麦叶片除TaSNAT和Cd浓度 10 mg/kg 下TaCOMT上调不显著外，其他处理TaASMT1、TaASMT2、TaCOMT、TaSNAT及 Ta2-ODD 的相对表达水平均显著上调，这些基因的上调可能促使SNAT、COMT、ASMT和M2H的活性增加，提高 5-HT、MLT和2-HMT的含量。MLT作为目前已知的抗氧化性最强的内源性ROS自由基清除剂［11］，不仅能直接清除小麦中Cd胁迫产生的过量ROS，其代谢物也可间接清除ROS，如 2-HMT 也是高效的抗氧化剂［14］。据报道，在植物中的几种MLT代谢产物中，2-HMT是植物中主要的羟基化MLT代谢物［48］。MLT直接或间接清除ROS，使植物中H2O2水平下降，缓解了Cd胁迫带来的氧化伤害，因此接种AMF能促进小麦的生长发育。

研究結果表明，AMF通过上调Cd胁迫小麦中TaASMT1、TaASMT2、TaCOMT、Ta2-ODD的表达水平，增强SNAT、COMT、ASMT及M2H的活性，从而提高5-HT、MLT和2-HMT的含量，增强小麦的抗氧化能力，缓解Cd胁迫带来的氧化伤害，增强小麦的Cd耐性，促进小麦生长发育。

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收稿日期：2022-12-04

基金項目：国家自然科学基金 （编号：31771730）。

作者简介：韩蕾蕾（1994—），女，河南周口人，硕士，从事镉污染修复小麦研究。E-mail：1678125333@qq.com。

通信作者：袁祖丽，博士，教授，从事丛枝菌根真菌对土壤重金属污染作物的生理、分子解毒机制研究。E-mail：zuliyuan@126.com。