牛冠状病毒TaqMan荧光定量检测方法的建立及国内部分地区流行病学调查

黄金　李思远　谢玲玲　周迪　杨蓉　王松　周华　蔡旭航　李基棕　李彬

摘要：牛冠状病毒（BCoV）在全球广泛存在，在临床上能引起牛腹泻以及呼吸道感染，给养殖业带来巨大经济损失。为快速批量检测临床样品、分析国内的BCoV隐性感染及流行情况，根据BCoV的N基因序列设计了引物和探针，建立了TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法，对其特异性、敏感性、重复性进行评估，并将其与靶向BCoV的N基因的常规RT-PCR方法进行对比。利用本方法对采集自我国西藏、江苏、河北、贵州、安徽等5个省份的22个未发病牛场的35份口腔拭子样品和244份粪便样品进行检测以了解流行情况。结果表明，质粒标准品拷贝数的对数与CT值呈现良好稳定的负线性关系，标准曲线为y=-3.441 8x+39.584 0，r2=0.999 4，E=98.2%；最低检测拷贝数为6.0×10拷贝/μL，重复性变异系数均<5%；对临床样品进行检测，检出率明显高于常规RT-PCR方法。对22个牛场的279份病料进行检测，结果显示BCoV的总体阳性率为73.12%，牛场阳性率为100.00%。本研究成功建立了靶向BCoV N基因、灵敏度高、特异性好的荧光定量RT-PCR检测方法，并初步掌握了我国5个省份BCoV的流行现状，为后续BCoV研究奠定了基础。

关键词：牛冠状病毒；TaqMan荧光定量；样品检测；隐性感染；RT-PCR

中图分类号：S852.65+3 文獻标志码：A 文章编号：1002-1302（2023）17-0029-05

牛冠状病毒（bovine coronavirus，BCoV）隶属于套式病毒目冠状病毒科冠状病毒属，为有囊膜的基因组为线性单股正链的RNA病毒［1］，临床上常引起犊牛出血性腹泻、成年牛冬季痢疾和呼吸道疾病。该病毒在世界范围内广泛存在，除感染牛以外，也可以感染野生反刍动物，如羊驼、麋鹿等。1988年，研究人员从德国1名儿童腹泻样品中分离出1株与BCoV基因组关系密切的毒株，提示BCoV存在跨物种传播的可能［2］。BCoV已严重影响病畜的生长发育和养牛业的健康发展，给养牛业造成了巨大的经济损失。

不同病原引起犊牛腹泻在临床和病理变化上极为相似，而利用PCR技术进行检测具有灵敏性高、特异性强、快速简单等优点，在病原诊断和流行病调查方面具有十分重要的地位。BCoV的全基因组大小约为32 kb，能编码5种主要结构蛋白，而其中高度保守的N基因序列常常被作为诊断BCoV病的靶向基因［3］。在此理论基础上，本研究以N蛋白核苷酸序列为靶向，建立了检测BCoV的TaqMan荧光定量RT-PCR方法，能够实现特异、灵敏、快速批量检测临床样品，便于开展BCoV的流行病学调查；本研究对我国5个省份的22个BCoV未发病牛场共279份牛样品进行筛查，旨在了解我国不同地区BCoV的流行感染情况，为我国部分地区的流行病学调查提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 病料、菌株及临床样品

BCoV病料、牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）、牛轮状病毒（bovine rotavirus，BRV）、牛星状病毒（bovine astrovirus，BAstV）、牛副流感病毒（bovine parainfluenza virus，BPIV）、牛传染性鼻气管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）、牛腺病毒（bovine adenovirus，BAV）、牛呼吸道合胞体病毒（bovine respiratory syncytial virus，BRSV）、牛源大肠杆菌K99、牛源产气荚膜梭菌的核酸样品，均由江苏省农业科学院兽医所实验室保存。

用于临床样品检测的样品：279份样品，2021年2月至2022年7月采集自西藏、江苏、河北、贵州、安徽各地的22个牧场，其中，河北7个牧场56份，西藏9个牧场94份，江苏4个牧场66份，贵州1个牧场31份，安徽1个牧场32份。所有样品均于江苏省农业科学院兽医所实验室-80  ℃保存。

1.2 主要试剂

RNA提取试剂盒、HiScriptⅡ RT SuperMix for qPCR、2×Phanta Max Master Mix（Dye Plus）、AceQ qPCR Probe Master Mix等，均购自Vazyme公司；质粒提取试剂盒、胶回收提取试剂盒，购自Omega Bio-Tek公司；pMD19-T载体，购自TaKaRa公司；DNA Marker购自南京擎科生物科技有限公司。

1.3 引物合成

根据BCoV（GenBank，MW711303.1）N蛋白核苷酸序列，选择N基因保守区域设计TaqMan法的特异性检测引物（BCoV-F，BCoV-R）和探针及构建质粒标准品的引物（N-F，N-R），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，详见表1。

1.4 标准品的构建与鉴定

2021年2月，通过临床样品检测鉴定得到BCoV阳性病料。对BCoV阳性病料进行处理后，采用RNA提取试剂盒获取RNA，反转录为cDNA，以其为模板，采用引物N-F、N-R进行PCR扩增；获得PCR产物跑核酸胶，胶回收后连接至pMD19-T载体；转化Trans5α、挑菌、提质粒，经常规PCR鉴定后，将阳性质粒送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，将测序正确的BCoV重组质粒作为标准品，测浓度，计算拷贝数。

1.5 优化反应体系及条件

20.0 μL反应体系（Mix 10.0 μL，探针0.2 μL，上下游引物各0.4 μL，染料0.4 μL，模板2.0 μL，ddH2O 6.6 μL），优化退火温度Tm（55～65 ℃），通过分析CT值和扩增曲线，确定最佳Tm；再以优化的最佳Tm对浓度为10 μmol/L的引物用量（0.2～1.2 μL）及 10 μmol/L的探针用量（0.1～1.0 μL）进行优化。

1.6 标准曲线的建立

将标准品稀释101～1012倍后作为检测模板，采用TaqMan荧光定量RT-PCR方法检测，获得拷贝数与CT值的线性关系，从而建立标准曲线。

1.7 特异性检验

以BCoV、BVDV、BRV、BAstV、BPIV、IBRV、BAV、BRSV、牛源大肠杆菌K99、牛源产气荚膜梭菌的cDNA/DNA为模板，以标准品（6.0×103拷贝/μL）为阳性对照，ddH2O为阴性对照加以扩增。

1.8 敏感性检验

将稀释的标准品作为模板，ddH2O为阴性对照扩增，每个稀释度做3次重复，与常规RT-PCR进行比较。

1.9 重复性检验

对6×104、6×106、6×108拷贝/μL稀释度的标准品进行批内重复性试验，每个检测浓度设置3次重复，分3个时间段。

1.10 样品检测

在35份牛口腔拭子样品中加入500 μL已灭菌的PBS，涡旋，4 ℃ 12 000 r/min离心3 min后，取病毒上清液200 μL加入400 μL的RL裂解，获得总RNA，反转录为cDNA；244份牛粪样品各取1 g加500 μL已灭菌的PBS充分涡旋，4 ℃ 12 000 r/min离心5 min，步骤同上。以获得的cDNA为模板，利用建立的TaqMan法进行BCoV检测，选10%阳性PCR产物送公司测序。

1.11 2种RT-PCR符合率的比较试验

将35份牛口腔拭子和244份牛粪便样品的cDNA分别用建立的荧光定量方法和常规RT-PCR分别检测，比较检测结果，同时送去测序，计算2种方法的符合率。

2 结果与分析

2.1 重组质粒的鉴定

以病料BCoV的cDNA为模板，利用引物 N-F/R 进行PCR扩增，样品跑胶后获得N基因片段全长，大小约为1 300 bp（图1）；切胶回收连于 pMD-19T 载体，转化入Trans5α，挑菌、摇菌提质粒鉴定，阳性质粒送测序，结果在NCBI上与BCoV其他株比对，同源性为100.00%，说明重组质粒构建成功。测得浓度为263.47 ng/μL，相应的拷贝数为 6.0×1012 拷贝/μL。

2.2 反应条件的优化结果

最佳反应体系及条件如下：AceQ qPCR Probe Master Mix 10.0 μL，探针0.2 μL，上下游引物各 0.4 μL（10 μmol/L），染料0.4 μL，模板2.0 μL，ddH2O 6.6 μL。反应程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40个循环。

2.3 扩增曲线和标准曲线的建立

将稀释成6×10～6×1012 拷贝/μL 的标准品分别作为模板扩增，获得曲线。由图2可知，标准品在6×10～6×108拷贝/μL与CT值呈现良好的负线性关系，得到标准曲线y=-3.441 8x+39.584 0，r2=0.999 4，扩增效率（E）为98.2%。

2.4 特异性检验结果

采用该方法对BCoV标准品及牛常见腹泻病原的核酸进行检测，结果（图3）表明，BCoV的标准品扩增结果为阳性，其他病原的核酸扩增结果均为阴性，表明该方法的特异性较强。

2.5 敏感性检验结果

采用该方法对经过10倍比稀释的标准品（6×10～6×1012拷贝/μL）进行扩增，并设置ddH2O为阴性对照。由图4可知，本方法对重组质粒标准品的最低检出拷贝数为6.0×10拷贝/μL，对应CT值约为36，敏感性为6.0×10拷贝/μL，与文献报道的检测下限［4］几乎相同；RT-PCR的最低检出拷贝数为6.0×103 拷贝/μL，表明该荧光定量方法敏感性更高。

2.6 重复性检验结果

在不同时间段用3个不同稀释度的标准品分别进行重复性试验，结果（表2）表明，该方法的批内和批间的变异系数均低于5%，具有良好的重复性。

2.7 常规RT-PCR和TaqMan法荧光定量 RT-PCR 检测方法的比较

由表3可知，常规RT-PCR对牛口腔拭子样品（n=35）和牛粪样品（n=244）的检出率分别为80.00%和34.01%，TaqMan法荧光定量RT-PCR检测方法则为91.42%和70.49%；2种方法检测牛口腔拭子的阳性符合率为87.50%，检测牛粪样品的阳性符合率为48.25%。测序结果经比对后发现，荧光定量方法判定为阳性的均为BCoV片段，表明本研究建立的方法准确性相对更高。

2.8 临床样品的检测结果

本次试验共检测279份样品，包括牛口腔拭子样品35份，牛粪便样品244份。由表4可知，BCoV的总检出率为73.12%，牛场阳性率为100.00%。为验证本次试验检测数据的真实可靠性，随机选取判定为阳性的样品进行测序验证，结果与预期相符，表明此方法可行。

3 讨论与结论

BCoV是引起牛消化道和呼吸道疾病的主要病原之一。1972年，美国的Mebus等曾在牛的腹泻病料中检出BCoV病原，此后在世界各地均陆续大量报道了该病的发生［5］。1985年，宋广林等首次报道了BCoV在我国大陆的存在情况［6］，随后在我国各省多次成功检出BCoV，阳性率高达70%，说明此病毒已在我国长期持续存在。但目前尚未研发出有效的疫苗及药物，因此，早期采取合理有效的疫病监测手段，及时淘汰阳性牛、隐形感染牛，是减少畜牧养殖业经济损失，遏制疾病传播的有效方法。

目前，国内外检测BCoV的方法有很多种，而实时荧光定量PCR检测速度快、敏感性好、特异性强、重复性强、准确率高，适用于大量样本的快速检测。国内外有些学者先后建立了BCoV的RT-PCR［7］、染料法荧光定量PCR［8-9］，而TaqMan法比其特异性更高。谭烁等以nsp10为靶向，建立了BCoV检测方法，与国外利用M基因方法进行比较，发现结果存在偏差，研究發现存在偏差的可能原因是M基因变异［4］。因此，本研究选择了BCoV保守的基因N为靶向设计引物和探针，避免传统检测方法中因为基因突变所产生的假阴性结果。本试验将重组质粒进行10倍比稀释作为标准品，获得标准曲线 y=-3.441 8x+39.584 0，r2=0.999 4，E=98.2%，表明所建立的方法扩增效率高，重复性强；检测实验室保存的常见腹泻病原的核酸，结果表明建立的检测方法能准确检测出BCoV，不产生交叉干扰；同时本试验的检测方法最低可检测到6×10拷贝/μL的核酸模板，与高辉等建立的荧光定量检测方法灵敏度在一个数量级上［10］。采用建立的检测方法，对5个省份的22个未发病牧场进行流行病学调查，采用常规RT-PCR进行同步检测，检测结果基本相符并且荧光定量检出的阳性数量多于常规RT-PCR，表明所建立的方法具有更高的灵敏性和准确性。

对5个省份22家牧场未发病的样品进行检测，牛场阳性率高达100%，说明我国牛场BCoV的感染率很高，BCoV广泛存在于牛场，但是常表现为不发病的隐性感染，潜伏性很强，通过临床表现观察不能检出。同时，有研究表明，BCoV導致牛群的发病与环境有很大关系，牛群的群体抵抗力下降（如环境不良等），易发生BCoV病［11］，提示或许是我国牛场养殖不规范不合理，生物安全防控不到位，导致我国牛场感染率过高。在5个省份牛场对BCoV病原的检测中，5个省份的检出率从6.25%～96.97%不等，5个省份的阳性检出率差别大。其中，江苏、西藏的感染率高，河北、贵州次之，安徽的感染率最低，这与刘蓉菁等的结果［12］一致。江苏、西藏、河北的感染率均高于50%，提示该地区导致牛腹泻的主要病原很可能是BCoV，需要引起高度重视；西藏、江苏的阳性率高于90%，推测两省对于BCoV的生物安全防控不是特别到位，导致BCoV在各省内大范围传播；西藏地区主要为牦牛，推测牦牛与普通牛相比更易感BCoV；或是牦牛的饲养方式与其他省份不同，牦牛的主要饲养方式是放牧，更容易导致病原的传播；或者西藏地区是否进化出使牦牛易感的特殊BCoV株；安徽省在此次检测中检出BCoV，与杨海峰等的研究结果［12］不一致，表明BCoV在我国的传染范围变大且持续存在。BCoV是感染消化道和呼吸道的病原，因此本次研究统一采用检测口腔拭子和牛粪便的方法，结果表明口腔拭子的检出率明显高于牛粪便，呼吸道型BCoV明显高于腹泻型BCoV，这与高辉等的调查结果［10］是一致的，推测可能是呼吸道BCoV引发的呼吸道疾病综合征［13-14］在临床上的表现症状轻，不易察觉；其次，本次结果提示在我国BCoV引起呼吸道感染的症状多于腹泻症状，但是由于本次口腔拭子样品有限，还需进一步检测研究。

本研究建立了一种以BCoV保守的N基因为靶向的TaqMan荧光定量方法，能够快速、特异、灵敏地检出BCoV的核酸；运用此检测方法对我国5省22个牧场进行流行病学调查，结果表明我国5省的BCoV总阳性率为73.12%，牛场阳性率高达100.00%。

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收稿日期：2022-11-11

资助项目：国家重点研发计划（编号：2021YFD1801101）；江苏省自然科学基金（编号：BK20221432）。

作者简介：黄 金（1999—），女，江西省赣州市人，硕士研究生，从事动物传染病防治和诊断技术研究。E-mail：1748916481@qq.com。

通信作者：李基棕，博士，副研究员，从事家畜重要疫病的病原学、致病机制与免疫防控技术研究，E-mail：lijizong22@sina.com；李 彬，博士，研究员，从事动物腹泻病防控技术、重要猪病感染与免疫的分子机制、新型疫苗和诊断试剂开发等研究，E-mail：libinana@126.com。