基于网络药理学和分子对接分析小续命汤治疗阿尔茨海默病的作用机制

邹旭欢,付雪琴,王玮玮,王漫漫,兰 瑞

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是一种以感觉或运动功能丧失、记忆力减退和痴呆症为主要表现的神经系统退行性改变,多发于中老年人,占全部痴呆类型的60%～80%[1]。我国2015—2018年AD患病率为6.6%,根据国家人口预测,2050年AD患病人数约为3 003万人,其病理学特征为淀粉样蛋白(amyloid-beta peptide,Aβ)沉淀形成的老年斑和tau蛋白的过度磷酸化形成的神经细胞内神经原纤维缠结,组织病理学研究显示,AD神经元细胞骨架不规则、突触异常[2-4]。AD病情的发生、发展与线粒体突触功能失常、Aβ的形成和积累、Tau蛋白的过度磷酸化、miRNA的失调、突触损伤、氧化应激、炎症反应、乙酰胆碱(acetylcholine,ACh)的缺失等密切相关[5]。目前,尚无特效药物可治愈或逆转AD的疾病过程,仅能减轻症状、延缓病情发展。小续命汤首见于孙思邈的《千金要方》,由12味药组成,历代医家常用来治疗中风病,现有的临床及动物实验表明,小续命汤可保护脑卒中后的神经血管单元、神经元细胞、线粒体等,除此之外,也在降血脂、抗凝血、改善学习记忆能力方面具有重要作用[6]。基于中医辨证施治的“异病同治”理论,研究发现,提取出的小续命汤有效成分组对β-淀粉样蛋白片段、L-谷氨酸、过氧化氢的损伤具有保护作用,且采用高效液相色谱法能够快速有效地分析小续命汤抗AD成分中的有效成分,为小续命汤治疗AD提供了可行的理论支撑[7-8]。小续命汤药物味数多、成分复杂,目前关于小续命汤治疗AD的具体作用机制尚未明确。因此,本研究采用网络药理学方法预测小续命汤有效成分治疗AD的潜在靶点和作用机制,并通过分子对接技术进行验证。

1 资料与方法

1.1 小续命汤有效成分与靶点预测

在中药系统药理学数据库和分析平台(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php,TCMSP)中查询药物的有效活性成分,并以通用的口服利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18为筛选标准进行初筛,核查去重后,获得小续命汤总的有效活性化合物。在UniProt数据库中进行靶点基因名转换,去重后获得小续命汤的靶点基因。

1.2 AD疾病相关靶点的获取

以“阿尔茨海默病(Alzheimer disease)”为检索词分别挖掘在线人类孟德尔遗传数据库(OMIM)、基因名片(GeneCard)数据库获得AD的潜在治疗靶点,合并数据库靶点,去重后获得总的AD靶点。

1.3 小续命汤治疗AD潜在靶点蛋白质相互作用(PPI)网络构建及拓扑分析

利用韦恩图制作软件Venny 2.1.0制作药物靶点与AD疾病交集图,将交集靶点输入STRING数据库构建PPI网络,设定物种“homo sapiens”,获得PPI网络并下载TSV文件。再将获得的TSV文件导入Cytoscape 3.7.2中,通过“Network Analyzer”工具进行拓扑分析,通过度值(Degree)排序,筛选核心靶点。利用Cytoscape 3.7.2绘制小续命汤药物-成分-作用靶点-疾病网络图。

1.4 关键成分通路富集分析

将交集靶点导入Metascape数据库进行基因本体(gene ontology,GO)分析与京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析,并绘制图形展示。

1.5 利用AutoDock Vina进行关键活性成分和靶点的分子对接

将筛选出的Degree值排名前5位的关键蛋白与其相应的关键活性成分进行能量匹配、空间匹配,展示靶点与成分之间的亲和力。

2 结 果

2.1 小续命汤有效成分获取与筛选

以OB≥30%和DL≥0.18为准则在TCMSP中筛选药物有效成分,最终获得小续命汤(麻黄、桂枝、防风、防己、杏仁、黄芩、人参、川芎、白芍、附子、甘草、生姜)有效成分共182种(见表1)。将获得的蛋白质靶点在UniProt数据库进行基因名匹对,剔除重复项后获得靶点基因272个。

表1 小续命汤的有效活性成分

2.2 AD疾病相关靶点的获取

检索OMIM疾病数据库,分别获得AD靶点835个,从Genecard数据库获得AD靶点9 606个,依照“相关性得分”(relevance score)进行中位数筛选,经过3次中位数筛选,最后以中位数11.428 988 46为界限,获得相关性较大的靶点1 201个,合并2个数据库靶点并去除重复值后获得1 834个靶点。

2.3 小续命汤与AD交集靶点韦恩图及PPI网络构建

分别将272个药物靶点与1 834个疾病靶点输入Venny 2.1.0软件,获得交集靶点139个(见图1),并导入String数据库,设定物种“homo sapiens”,构建小续命汤药物与AD蛋白相互关系网络图(见图2)。

图1 小续命汤治疗AD交集靶点韦恩图

图2 小续命汤治疗AD交集靶点PPI网络图

2.4 基于PPI网络的拓扑分析

将获得的TSV文件导入Cytoscape 3.7.2,利用Net work Analyer插件计算得出靶点的相关度评分,根据Degree值获得小续命汤治疗AD关键靶点,与AD相关的排名前5位的靶点为信号转导和转录激活因子3(STAT3)、P53肿瘤蛋白(TP53)、丝裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)、V-REL网状内皮增生病毒癌基因同源物A重组蛋白(RELA)、丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT1)。详见表2。利用Cytoscape 3.7.2绘制小续命汤药物-成分-作用靶点-疾病网络图(见图3),并计算Degree值,筛选出排名前5位的活性成分,分别是槲皮素、山柰酚、木樨草素、汉黄芩素、β-谷甾醇(见表3)。

图3 小续命汤药物-成分-作用靶点-疾病网络图(红色圆形为疾病名称,粉色菱形为靶点基因,绿色正方形为药物成分,橘黄色椭圆形为药物活性成分)

表2 小续命汤治疗AD排名前20位的靶点

表3 小续命汤治疗AD的关键活性成分

2.5 小续命汤治疗AD的潜在靶点GO富集分析

GO富集分析获得AD相关的5 231条生物过程(BP),结果显示,小续命汤治疗AD在生物过程中,主要参与对无机物的反应(response to inorganic substance)、对激素的反应(response to hormone)等。在细胞组分(CC)富集到486项,说明治疗过程中主要通过膜筏(membrane raft)、囊腔(vesicle lumen)、质膜外侧(external side of plasma membrane)、受体复合体(receptor complex)、内质网内腔(endoplasmic reticulum lumen)等部位进行。分子功能(MF)富集到712项,其中信号受体调节活性(signaling receptor regulator activity)、激酶结合(kinase binding)、蛋白质同源二聚化活性(protein homodimerization activity)等最为紧密。选取结合度排名前10位的结果进行可视化,绘制柱状图,柱状图横轴代表生物学过程,纵轴代表靶点的数量。详见图4。

图4 GO分析柱状图

2.6 小续命汤治疗AD潜在靶点KEGG通路富集分析

在KEGG通路富集结果中,共富集到259条通路,结果显示,脂质与动脉粥样硬化通路(lipid and atherosclerosis)、晚期糖基化终末产物-糖基化终末产物受体信号通路(advanced glycosylation end products-receptor of AGEs,AGE-RAGE)、神经退行性病变相关通路(pathways of neurodegeneration-multiple diseases)、缺氧诱导因子-1(HIF-1)信号通路(HIF-1 signaling pathway)等与小续命汤治疗AD密切相关。关系紧密的前10条通路通过气泡图进行展示。详见图5。

图5 KEGG富集气泡图

2.7 利用AutoDock Vina进行关键活性成分和靶点的分子对接

分别通过PubChem和PDB数据库获取关键成分的3D结构及核心蛋白质结构,运用Autodock Vina软件进行分子对接,Pymol软件可视化显示,且分子对接结果显示STAT3、AKT1与槲皮素结合更紧密。详见图6、表4。

图6 有效成分槲皮素、山柰酚、汉黄芩素与STAT3、AKT1结合位点图

表4 关键分子与靶点对接亲密度

3 讨 论

AD属中医“痴呆”范畴,病属本虚标实,以肾虚为本,痰浊、瘀血为标[9]。小续命汤出自《千金要方》,为治疗中风的常用方剂,治疗中风病标本兼顾,收效颇丰。小续命汤中用附子引人参走于十二经,温阳复阳以固肾,引川芎入血分,行血养血以滋养真阴。元阳、真阴藏于肾,痴呆起病以肾虚,小续命汤温阳滋阴固肾,故而治于痴呆。

在对活性成分的筛选中,筛选出槲皮素、山柰酚、木樨草素、汉黄芩素、β-谷甾醇等排名靠前。槲皮素存在于麻黄、甘草中,可穿透血脑屏障而发挥神经保护作用[10]。研究表明,槲皮素可抑制Aβ聚集和Tau磷酸化,抑制乙酰胆碱酯酶活性、抗氧化应激,并减轻炎症反应,在3xTg-AD转基因AD小鼠模型,腹腔注射槲皮素进行治疗,可减少AD小鼠海马和杏仁核中的Tau蛋白过度磷酸化、Aβ的堆集,从而改善认知功能[11]。乙酰胆碱的缺失会导致AD症状加重,乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AChE)可降解ACh,抑制AChE活性可改善AD的认知障碍[1]。槲皮素是AChE和丁酰胆碱酯酶(butyrylcholinesterase,BChE)的竞争性抑制剂,可抑制AChE继发于疏水性相互作用和与酶的强氢键结合,从而减少ACh的水解[12]。线粒体是活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生的主要部位,线粒体功能障碍可导致ROS过度积累,从而产生氧化应激,随后ATP耗竭导致细胞死亡[13-14]。槲皮素作为有效的抗氧化剂,通过诱导核因子E2相关因子2/抗氧化反应元件通路(Nrf2/ARE)和对氧磷酶2(paraoxonase 2,PON2)激活调节AD中错误折叠的蛋白质聚集体的形成和降解[13,15]。槲皮素通过抑制小胶质细胞中一氧化氮、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达,以减轻炎症,延缓AD的进展[16]。山柰酚存在于中药麻黄、白芍、甘草、人参中,研究发现,AD模型果蝇暴露于山柰酚环境中可降低氧化应激和AChE活性,延缓攀爬能力、记忆力的丧失[2]。Aβ-42的沉积会增加AChE的表达,乙酰胆碱酯酶活性升高、乙酰胆碱转移酶活性的降低,使AD病人脑内的ACh的表达明显减少,而山柰酚可以降低Aβ-42的毒性,并与其寡聚体结合,形成无毒寡聚体,进而阻断Aβ斑块的构象转变,以改变Aβ诱导的神经元坏死、氧化应激、炎症反应、小胶质细胞活化等一系列加重AD病情的病理过程[17-18]。汉黄芩素存在于防风、黄芩中,研究发现,其可通过抑制雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路自噬介导促进原代神经星形胶质细胞中Aβ的清除,从而抑制糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)以减少Tau蛋白的磷酸化,通过下调促分裂素原活化蛋白激酶/核转录因子(MAPK/NF-κB)信号通路以缓解Aβ25-35刺激的PC12细胞中的神经元凋亡和炎症发挥神经保护作用,以达到治疗AD的目的[19-20]。木樨草素存在于麻黄中,β-谷甾醇存在于小续命汤多味中药中,研究发现,木樨草素和β-谷甾醇均具有较强的抗氧化、抗炎作用[21-22]。对于PPI网络关键靶点质谱分析中,STAT3、AKT1、TNF、血管内皮生长因子A(VEGFA)等靶点对小续命汤治疗AD起到关键作用。在AD病理环境的刺激下,小胶质细胞激活,促进神经斑块附近的星形胶质细胞活化为A1型,高表达凋亡相关基因,损伤神经突触,推进AD病程的进展[23]。在对AD的实验研究中发现,可通过调控Janus激酶2(JAK2)/STAT3信号通路抑制星形胶质细胞活化,并负反馈调节抑制蛋白3(SCO3)的表达,抑制促炎的释放,减轻神经炎性反应,修复神经元结构和功能[24-25];并可调控STAT3参与的miR-124/STAT3轴以抑制Aβ诱导的海马神经元凋亡,从而治疗AD[26]。AKT1可在不同的通路中发挥抗AD的作用,研究表明,在其参与的PI3K/AKT通路的活性减少会增加Tau蛋白磷酸化以及Aβ斑块沉积增加,AKT基因过度表达可降低Tau蛋白过度磷酸化[27-28];而抑制AKT1-mTOR信号通路表达可以诱导自噬以延缓AD模型衰老和Aβ的表达水平[29]。ROS介导的AKT1的氧化修饰可导致AD中的突触功能障碍,在突触中促进AKT1-mTOR信号传导的治疗策略可能为AD的疾病缓解治疗提供新的靶标[30]。TNF-α是小胶质细胞在被持续激活状态下释放的,可加重AD的神经元变性和脑组织损伤[31-32]。在使用遗传和药理学的研究表明,TNF-α信号传导在体内会加剧Aβ和Tau病理[33]。且研究发现,TNF-α可抑制胆碱能神经元突触传递,加重中枢胆碱能系统损害[3]。VEGFA是一种高度特异性地促血管内皮细胞生长因子,可促进血管内皮细胞迁移和血管新生,血管内皮细胞损伤会增强血脑屏障的通透性,使外周Aβ更易进入大脑,脑内Aβ含量堆集,外周的有害物质更易进入大脑,激活小胶质细胞释放促炎因子,诱发神经元凋亡,从而诱发痴呆[34]。

AD病人分为轻、中、重3度,轻度病人主要以近期记忆力丧失、视空间障碍为主;中度病人学习新知识、工作能力减退,出现明显的人格改变;重度病人已不能完成基本日常活动,终日无语而卧床,与外界逐渐丧失接触能力,因此,营养水平与AD的发展及预后呈正相关[4]。脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)可提高学习与记忆能力,研究表明,AD病人的BDNF表达下降,血清BDNF、尿酸(UA)水平与病人认知功能损伤呈负相关[35-36]。在本课题组的前期研究中发现,在脑缺血再灌注损伤动物模型中,小续命汤可上调缺血半暗带皮层BDNF、胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)的表达,减轻急性脑缺血再灌注导致的神经细胞损伤,改善神经功能缺损症状[37]。这为小续命汤治疗AD提供了理论支撑。

KEGG信号通路富集结果显示,小续命汤治疗AD可能与脂质与动脉粥样硬化通路、AGE-RAGE信号通路等有关。动脉粥样硬化不仅是缺血性脑卒中的危险因素,也是认知障碍的相关因素,而且年龄、动脉高血压、高胆固醇血症、糖尿病和肥胖是AD和动脉粥样硬化的共同危险因素,针对危险因素治疗AD、动脉粥样硬化也是临床治疗的共通点[38]。在临床研究中发现,通过对比患有和未患有脑血管动脉粥样硬化的AD病人2年内的神经认知功能和日常生活活动的过程发现,患有脑血管动脉粥样硬化的AD病人,在神经心理学评估下的认知能力呈现进行性损害且不受动脉粥样硬化患病时间和颅外或颅内位置的影响,动脉粥样硬化通过减少脑血流量引起大脑缺氧从而促进脑内Aβ的积累,加重AD,而Aβ的积累又可通过影响内皮功能、氧化应激和炎症反应促进动脉粥样硬化的发生[39-41]。在动物实验中发现,通过CCAAT-增强子结合蛋白(C/EBPβ)/天冬氨酸内肽酶(AEP)信号通路传导可将动脉粥样硬化与AD的发病机制结合起来,AEP是由酸中毒激活的半胱氨酸蛋白酶,主要存在于内切溶酶体中,其作为δ-分泌酶分别在N585和N368残基处切割I类跨膜蛋白(APP)和Tau,加速Aβ的产生和Tau聚集[42]。用小分子抑制剂抑制AEP可阻断AD病变,改善AD小鼠模型中的认知功能障碍,颈动脉粥样硬化病人的颈动脉斑块和血浆中的AEP均增加[43-45]。而C/EBPβ在衰老过程中调节AEP的基因(LGMN)mRNA转录,从3xTg小鼠中敲除C/EBPβ可降低AEP水平并消除AD病变,恢复认知功能[46]。高脂血症载脂蛋白E敲除(ApoE-/-)小鼠中C/EBPβ的造血缺失可减轻炎症和高脂血症,从而中断动脉粥样硬化的病理发展[47]。2型糖尿病(diabetes mellitus type 2,T2DM)与AD之间的临床关系存在争议,虽然两者之间并没有明确的相关性,但有研究表明T2DM是AD的独立危险因素,两者都与衰老和晚期局部淀粉样蛋白沉积有关,胰岛素异常、胰岛素抵抗和晚期糖基化终产物(AGEs)对神经淀粉样蛋白斑块和神经原纤维缠结的发展都有影响[5]。胰岛素可调节AD发病过程中淀粉样蛋白、神经原纤维缠结的主要成分Aβ和Tau的代谢,通过竞争胰岛素降解酶参与Aβ降解的金属蛋白酶,促进Aβ沉积[6]。而AGE及其受体RAGE对ROS反应敏感,从而增加相互作用,促进Aβ的合成,导致Aβ沉积和Tau蛋白磷酸化,最终形成了斑块和神经原纤维缠结[7]。且高迁移率族框1(HMGB1)和与RAGE相互作用以产生其他ROS的S100的合成,从而增强AD病理学进展[48]。

综上所述,小续命汤通过多成分、多靶点、多通路治疗AD,靶向作用STAT3、AKT1、TNF、VEGFA等关键靶点,涉及抗氧化应激与体内营养水平进行治疗,涉及激酶结合、蛋白质同源二聚化活性、蛋白质结构域特异性结合、氧化还原酶活性等分子功能,作用于膜筏、囊腔、突触后膜、受体复合体等细胞部位。本研究利用网络药理学收集了小续命汤治疗AD的潜在靶点,可能为进一步研究小续命汤治疗AD的实验及临床应用提供理论依据,但由于数据库不全,导致可能数据收集不完备,潜在靶点及可能机制无法进行全面的挖掘及分析,此外,小续命汤治疗AD的研究较少,尚未形成完整的理论及实验验证体系,尚需进一步研究明确小续命汤治疗AD的潜在机制,为AD的治疗提供科学的理论指导、理论指导实验、实验验证理论,对小续命汤治疗AD的作用机制进行更深一步的研究。