猪A群轮状病毒VP6单克隆抗体的制备和初步鉴定

李科茫，周金柱，周俊明，牛贝贝，武琦，郭容利，张雪寒，朱雪蛟，李彬*，粟硕

(1. 南京农业大学动物医学院，江苏 南京 210095；2. 江苏省农业科学院兽医研究所，江苏 南京 210014)

轮状病毒(rotavirus，RV)是一类无囊膜的双链RNA病毒，因病毒粒子独特的“车轮状”外观形态而得名，其结构包括三层同心衣壳及其包裹着的11个分节段的双股RNA；这些RNA节段分别编码6种病毒结构蛋白(VP1，VP2，VP3，VP4，VP6和VP7)及6种非结构蛋白(NSP1，NSP2，NSP3，NSP4，NSP5和NSP6)[1]。根据VP6的序列及抗原性差异，RV被分为A至J共10个群[2-4]。此外，根据VP7和VP4的序列差异，通过G/P双命名系统又可将A群轮状病毒(group A rotavirus，RVA)进一步分为不同的G基因型和P基因型[5]。

RV能够引起人类，鸟类及多种哺乳动物的急性腹泻[6]。历年来的统计数据显示，全球每年预估至少有215 000名5岁以下儿童死于RV感染[7]。猪作为一种与人密切相关的家畜，已被证实能够感染A、B、C、E、H血清群RV，同时，A、B、C血清群RV也被证实与仔猪腹泻具有相关性[8]。由于猪RVA相对其他血清群拥有更高的患病率及更强的致病性，以及其较易通过细胞培养分离的特点[9]，受到更多的关注。此外，日前全球新发的人RVA，诸如G9和G12基因型，被认为很有可能通过猪源的RVA基因重配产生，与此同时，部分感染人和猪的RVA有着相同的G/P基因型组合，也说明人和猪之间RV直接传播的可能，这些都提示猪RVA的人兽共患潜力，具有重要的公共卫生学意义[9]。基于上述原因，猪RVA的常态化流行病学监测不可或缺。

目前使用最广泛的RV检测方法为基于粪便样本中RV病毒颗粒上蛋白质抗原的检测，在这之中，RV特异性抗体相关的ELISA检测方法更是RV大规模监测的不二之选[10]。为了开发特异性强、灵敏性高、可重复性佳的ELISA检测方法，针对某一特定抗原表位、高度均一、易于标准化大批量生产的单克隆抗体自然不可或缺。RV的VP6蛋白是一类大小约为45 kDa且高度保守的病毒蛋白，其含量丰富，约占病毒粒子质量的50%～60%[11-12]。由于其丰度和抗原交叉反应性，VP6蛋白常被作为RV检测的各类相关免疫学试验的首要目标[13]。此外，VP6蛋白组成了RV的中间衣壳层，大量证据表明靶向该蛋白的特异性抗体在防止轮状病毒感染过程中起到了重要作用。机体在感染轮状病毒或接种其疫苗后，往往产生高滴度的VP6特异性抗体[14-15]。针对VP6的抗体或纳米抗体，在感染轮状病毒的小鼠和仔猪上，也显示了其被动保护力[16-19]。然而，目前VP6抗体介导的保护机制尚未得到完全表征。本研究以原核表达的VP6重组蛋白为抗原免疫小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，间接ELISA方法筛选获得一株稳定分泌抗VP6蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株5G9，为猪RVA的生物学特性、免疫机制、流行病学调查、诊断、治疗等方面的研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 病毒、细胞与试验动物

猪RVA毒株NJ2012、猪RVA毒株宁86，由本实验室分离保存；牛RVA毒株NCDV、猴RVA毒株SA11、猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus，PDCoV)，由本实验室保存。SP2/0细胞、Vero细胞、LLC-PK1细胞、ST细胞，由本实验室保存；6～8周龄雌性BALB/c小鼠，购自扬州大学比较医学中心。

1.2 质粒与菌株

原核表达载体pET28a-SUMO由本实验室保存；DH5α，BL21(DE3)化学感受态细胞购自北京全式金生物技术公司。

1.3 主要试剂

RNA柱式提取试剂盒、逆转录试剂盒、高保真DNA聚合酶和DNA聚合酶，购自诺唯赞生物科技公司；限制性内切酶、T4 DNA连接酶，购自Thermo Scientific公司；凝胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒，购自Omega Bio-tek公司；诱导剂IPTG购自Biosharp公司；蛋白质纯化层析柱购自Cytiva公司；HRP标记羊抗鼠IgG购自Proteintech公司；GEL 01佐剂购自SEPPIC公司；胎牛血清购自Gibco和Biological Industries公司；RPMI 1640培养基和DMEM培养基购自源培生物科技公司；PEG溶液、HAT和HT培养基补充物，购自Sigma-Aldrich公司；FITC标记羊抗鼠IgG、DAPI、RIPA裂解液，购自碧云天生物公司；小鼠单抗Ig类亚类鉴定用酶标二抗即用试剂盒购自博特龙免疫技术公司

1.4 VP6基因的扩增

使用RNA柱式提取试剂盒FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit，按说明书操作提取猪RVA毒株NJ2012感染细胞上清病毒基因组RNA，使用逆转录试剂盒HiScript Ⅱ Q RT SuperMix，按说明书操作进行逆转录合成cDNA。以合成的cDNA为模板，PCR引物设计参考上传GenBank的猪RVA毒株NJ2012 VP6基因节段(GenBank登陆号MT874988)编码区序列，上下游引物5′端分别引入保护碱基及酶切位点BamHⅠ和HindⅢ，交由南京金斯瑞生物科技公司合成，引物相关信息见表1，参考高保真DNA聚合酶Phanta Max Master Mix说明书配制。PCR反应体系：95 ℃ 3 min；循环步骤95 ℃ 15 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 90 s，共循环35次；72 ℃ 5 min。以此反应程序进行PCR扩增VP6基因。

表1 PCR引物相关信息

1.5 原核表达载体pET28a-SUMO-VP6的构建

VP6基因PCR扩增产物经BamHⅠ和HindⅢ限制性内切酶双酶切并切胶回收后，与同样经BamHⅠ和HindⅢ双酶切并回收后的pET28a-SUMO载体连接过夜，连接产物转化至DH5α化学感受态细胞，挑取菌落PCR鉴定为阳性的菌落，扩大培养后提取质粒进行酶切鉴定，鉴定正确的质粒送至擎科生物科技公司进行测序验证。

1.6 重组蛋白SUMO-VP6的表达与纯化

将测序正确的质粒转化至BL21(DE3)化学感受态细胞，挑取PCR鉴定为阳性的菌落接种于含卡那霉素抗性的LB液体培养基过夜培养，将过夜培养物1∶100转接至含卡那霉素抗性的LB液体培养基37 ℃震荡培养至对数期，加入终浓度为0.8 mmol/L IPTG诱导表达6 h，利用SDS-PAGE对重组蛋白表达情况进行分析。小量诱导表达试验确定目的重组蛋白表达形式为包涵体后，以相同条件大量诱导表达重组蛋白，使用蛋白质纯化层析柱HisTrap HP，按说明书操作以含8 mol/L尿素的结合缓冲液溶解包涵体，离心取上清液，过柱纯化重组蛋白SUMO-VP6，Western blot验证该重组蛋白与小鼠抗轮状病毒血清的免疫反应性。

1.7 小鼠免疫

GEL 01佐剂与等体积重组蛋白SUMO-VP6涡旋混匀后，对6～8周龄雌性BALB/c小鼠，按每只小鼠每次50 μg重组蛋白的剂量行后肢肌肉注射，每隔2周加强免疫1次，第3次免疫结束后10 d测定其血清抗体水平，取血清抗体水平高的小鼠，在融合前3 d腹腔注射50 μg不含佐剂的重组蛋白进行冲击免疫。

1.8 细胞融合及阳性杂交瘤细胞的筛选与亚克隆

小鼠冲击免疫5 d后脱颈处死，无菌操作取脾研磨并通过40 μm细胞滤器制备脾细胞悬液，后续脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合主要参考Yokoyama等[20]的方法。融合细胞铺板5 d后使用含HAT的培养基半量换液，后续隔天使用含HT的培养基半量换液，铺板14 d后间接ELISA筛选，包被抗原使用纯化的重组蛋白SUMO-VP6，以及参考Arnold等[21]的方法纯化的猪RVA毒株NJ2012，将阳性杂交瘤细胞扩大培养，并参考Fuller等[22]的方法，通过有限稀释法将杂交瘤细胞稀释至每毫升细胞悬液含8个细胞，每孔100 μL加入已铺有饲养层细胞的96孔细胞板内，后续对其进行至少3轮亚克隆，得到能够稳定分泌针对VP6蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

1.9 单克隆抗体5G9与猪RVA毒株NJ2012反应性的验证

1.9.1 Western blot验证

将纯化后的猪RVA毒株NJ2012加入含硫基还原剂的蛋白上样缓冲液，100 ℃水浴加热10 min完全变性后进行SDS-PAGE，电泳结束后产物转印至醋酸纤维素膜，分别以杂交瘤细胞上清液，小鼠抗VP6血清，SP2/0细胞上清液作一抗，HRP标记羊抗鼠IgG作二抗进行Western blot。

1.9.2 间接免疫荧光验证

将猪RVA毒株NJ2012以3 MOI的量接种Vero细胞，感染6 h后冷甲醇固定，分别以杂交瘤细胞上清液，小鼠抗VP6血清，SP2/0细胞上清液作一抗，FITC标记羊抗鼠IgG作二抗，DAPI作细胞核染色，荧光显微镜下观察并成像。

1.10 小鼠腹水制备单克隆抗体

小鼠腹水制备单克隆抗体主要参考Hendriksen等及Yokoyama等[23-24]的方法，老龄雌性BALB/c小鼠腹腔注射0.5 mL灭菌后的液体石蜡致敏，10～14 d后，小鼠腹腔注射0.5 mL含3×106个杂交瘤细胞的PBS；同时，设置SP2/0细胞阴性对照小鼠，约7～10 d后，待小鼠腹部鼓胀明显，穿刺取腹水，腹水离心取上清液分装并保存于-20 ℃冰箱备用。

1.11 单克隆抗体效价测定及亚类鉴定

通过间接ELISA对小鼠腹水及杂交瘤细胞上清液单抗效价进行测定，重组蛋白SUMO-VP6以终浓度1.25 μg/mL稀释于碳酸盐缓冲液，每孔50 μL进行抗原包被，以含5%脱脂乳的PBST二倍比稀释小鼠腹水及杂交瘤细胞上清液，小鼠腹水起始稀释度为1∶6 000，杂交瘤细胞上清液起始稀释度为1∶5，同时设置阴性小鼠腹水及SP2/0细胞上清液对照，将大于阴性对照吸光度2.1倍的最高稀释度视作单克隆抗体效价。根据小鼠单抗Ig类亚类鉴定试剂盒说明书，对小鼠单克隆抗体的类别，亚类及轻链类型进行鉴定。

1.12 单克隆抗体5G9与不同RVA的反应性

将猴RVA毒株SA11、牛RVA毒株NCDV、猪RVA毒株宁86和NJ2012，以3 MOI的量接种Vero细胞，感染6 h后加入RIPA裂解液裂解，充分裂解后离心取上清液加入含硫基还原剂的蛋白上样缓冲液，100 ℃水浴加热10 min完全变性后进行SDS-PAGE，电泳结束后产物转印至醋酸纤维素膜，以小鼠腹水单抗5G9作一抗，HRP标记羊抗鼠IgG作二抗进行Western blot。

1.13 单克隆抗体5G9与常见猪腹泻相关病毒的反应性

将PEDV以0.03 MOI的量接种Vero细胞，感染18 h后收样；TGEV以1 MOI的量接种ST细胞，感染18 h后收样；PDCoV以0.6 MOI的量接种LLC-PK1细胞，感染20 h后收样；猪RVA毒株NJ2012以3 MOI的量接种Vero细胞，感染6 h后收样。蛋白样品处理同1.12，以小鼠腹水单抗5G9作一抗，HRP标记羊抗鼠IgG作二抗，进行Western blot。

2 结果

2.1 VP6基因的扩增及原核表达载体pET28a-SUMO-VP6的构建

病毒基因组RNA经RT-PCR扩增得到大小约为1 200 bp的目的片段(图1A)。将该片段克隆至pET28a-SUMO载体，并转化至DH5α化学感受态细胞，挑取PCR鉴定为阳性的菌落，扩大培养后提取质粒并进行酶切鉴定，重组质粒经BamHⅠ单酶切线性化后，得到1条大小约为6 800 bp的片段。经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后，得到2个条带，大小约为 5 600 bp和1 200 bp的片段，上述片段大小均符合预期(图1B)，后续将酶切鉴定正确的质粒送测序，测序结果中重组质粒的VP6基因序列与读码框均正确，未出现突变或移码，表明成功构建原核表达载体pET28a-SUMO-VP6。

M. DNA分子量标准；1. VP6基因RT-PCR产物；2. ddH2O对照；3. 重组质粒pET28a-SUMO-VP6单酶切产物；4. 重组质粒pET28a-SUMO-VP6双酶切产物

2.2 重组蛋白SUMO-VP6的表达与纯化

将测序正确的原核表达载体pET28a-SUMO-VP6转化至BL21(DE3)化学感受态细胞，小量诱导表达试验对重组蛋白表达情况进行SDS-PAGE分析(图2A)，结果表明重组BL21(DE3)大肠杆菌37 ℃诱导6 h后，在约60 kDa处出现1条特异性蛋白条带，大小与目的蛋白预期值相符，而未经诱导的重组菌则未见该条带；诱导后的重组菌经超声破碎后的上清和沉淀组分显示该重组蛋白在宿主菌内以包涵体形式表达，后续大量诱导表达重组蛋白，并以含8 mol/L尿素的结合缓冲液溶解包涵体，镍柱亲和层析纯化得到条带相对单一的重组蛋白SUMO-VP6，后续Western blot分析结果显示，在约60 kDa处出现一特异性条带，表明该重组蛋白能够与小鼠抗轮状病毒血清反应(图2B)。

M.蛋白质分子量标准；1. 未经诱导的重组大肠杆菌BL21(DE3)全菌；2. 经诱导的重组大肠杆菌BL21(DE3)全菌；3. 经诱导的重组大肠杆菌BL21(DE3)裂解产物可溶性组分；4. 经诱导的重组大肠杆菌BL21(DE3)裂解产物不可溶性组分；5. 纯化后的重组蛋白SUMO-VP6；6. 未经诱导的重组大肠杆菌BL21(DE3)全菌；7. 经诱导的重组大肠杆菌BL21(DE3)全菌；8. 纯化后的重组蛋白SUMO-VP6；

2.3 阳性杂交瘤细胞株的获得

细胞融合后，各孔杂交瘤细胞上清经多次重组蛋白及全病毒间接ELISA筛选，阳性杂交瘤细胞后续进行至少3轮亚克隆，最终获得一株能够稳定分泌针对RV VP6蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株5G9。

2.4 单克隆抗体5G9与猪RVA毒株NJ2012反应性的验证

纯化后的猪RVA毒株NJ2012经SDS-PAGE后转印至醋酸纤维素膜，分别以阳性杂交瘤细胞上清液5G9、小鼠抗VP6血清、SP2/0细胞上清液作一抗，HRP标记羊抗鼠IgG作二抗，Western blot分析结果显示，杂交瘤细胞上清液试验组及抗VP6血清阳性对照组在约40 kDa处均出现一特异性条带，大小与轮状病毒VP6蛋白大小基本相符，而SP2/0细胞上清液阴性对照组未见特异性条带(图3)。

感染猪RVA毒株NJ2012的Vero细胞固定后，分别以阳性杂交瘤细胞上清液5G9、小鼠抗VP6血清、SP2/0细胞上清液作一抗，FITC标记羊抗鼠IgG作二抗(绿色)，DAPI作细胞核染色(蓝色)，间接免疫荧光试验结果显示，杂交瘤细胞上清液试验组及抗VP6血清阳性对照组镜下可见绿色荧光，而SP2/0细胞上清液阴性对照组则未见绿色荧光，仅可观察到经DPAI染色的蓝色细胞核(图4)。上述结果均表明，单克隆抗体5G9能够与猪RVA毒株NJ2012的VP6蛋白特异性结合。

2.5 单克隆抗体效价测定及亚类鉴定

间接ELISA结果显示，小鼠腹水单抗效价可达1∶4 096 000，杂交瘤细胞上清液单抗效价可达1∶10 240，小鼠单抗Ig类亚类鉴定结果显示为IgG1，轻链类型为Kappa。

2.6 单克隆抗体5G9与不同RVA的反应性

感染不同RVA的Vero细胞裂解后收取的蛋白样品经SDS-PAGE，以小鼠腹水单抗5G9作一抗，并按照1∶1 000进行稀释，HRP标记羊抗鼠IgG作二抗，Western blot分析结果表明，单克隆抗体5G9能够与不同RVA的VP6蛋白特异性结合(图5)。

M.蛋白质分子量标准；1. 猴轮状病毒SA11；2. 牛轮状病毒NCDV；3. 猪轮状病毒宁86；4. 猪轮状病毒NJ2012；5. 不感染的Vero细胞对照样品

2.7 单克隆抗体5G9与常见猪腹泻相关病毒的反应性

感染常见猪腹泻相关病毒的细胞裂解后收取的蛋白样品经SDS-PAGE，以小鼠腹水单抗5G9作一抗，并按照1∶1 000进行稀释，HRP标记羊抗鼠IgG作二抗，Western blot分析结果表明，单克隆抗体5G9不与其他常见猪腹泻相关病毒发生特异性反应(图6)。

M.蛋白质分子量标准；1. 猪流行性腹泻病毒；2. 猪德尔塔冠状病毒；3.猪传染性胃肠炎病毒；4. 猪轮状病毒NJ2012；5. 不感染病毒的Vero细胞对照样品

3 讨论

猪RVA能够引起仔猪腹泻、脱水甚至死亡，常与其他肠道病原体混合感染导致其临床症状加重[9]，给国内养猪业造成了巨大的损失。然而，目前国内上市的猪轮状病毒疫苗相关产品还较少，防控手段的缺乏，轮状病毒无处不在的特性及人畜共患的潜力，都提示我们针对猪RVA的常态化流行病学监测不可或缺。猪RVA感染临床症状与其他肠道病原体类似，因此必须采取实验室检测才能明确诊断。RT-PCR和荧光定量PCR由于其较高的灵敏度和特异性，常常被用于轮状病毒的检测，但是，此类型的检测需要昂贵的仪器设备和试剂耗材以及受过专业培训的研究人员，往往只能在专业诊断实验室开展，增加了养殖从业人员的生产成本[25]。免疫测定(以ELISA为代表),检测成本相对较低,易于使用,且检出结果速度较快,已成为检测轮状病毒抗原的首选诊断方法[26]。

本研究根据上述临床需求，利用大肠杆菌原核表达系统表达并纯化猪RVA群抗原VP6蛋白，以此为免疫原免疫小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞，通过筛选、验证及亚克隆进而获得一株能稳定分泌针对VP6蛋白单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株5G9，反应性良好，该单抗不与常见的猪腹泻相关病毒反应，具备良好的特异性，同时，能够与不同基因型，感染不同物种的RVA反应，为未来猪RVA临床相关免疫测定方法的开发，猪RVA的流行监测，乃至调查RVA跨物种流行事件的发生，以及猪RVA生物学特性、免疫机制等相关基础研究奠定基础。