转录因子SP1调控肝细胞癌中三元基序家族蛋白7基因表达的机制

樊昌宇, 丁 涵, 徐乙冉, 咸 蕊, 闫凤娟

(江苏师范大学生命科学学院生物化学与分子生物学教研室, 江苏 徐州 221116)

原发性肝癌是临床上最常见的恶性消化道肿瘤之一,而我国是原发性肝癌高发的国家,患病人数约占全球患病人数的一半[1]。根据2022年癌症统计数据结果显示,我国肝癌新发病例数高达43.1万例,在所有癌症中排名第四,死亡人数达到41.2万人,位列第2[2]。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全世界高发的肝癌类型,约占原发性肝癌总数的85%～90%[3]。尽管近年来医疗技术和治疗方法有所改进,但肝细胞癌患者的5年生存率仍低于20%[4]。因此,深入探索调控肝细胞癌发生发展的关键分子,对于开发新的肝癌诊断分子标志物和治疗靶点提供重要的理论基础。

TRIM7(tripartite motif-containing protein 7)又称作糖原结合蛋白(GNIP1),是2002年首次被鉴定出的E3泛素连接酶TRIM家族新成员[5],其蛋白质结构由1个RING结构域、2个B-Box结构域以及1个PRY/SPRY(B30.2)结构域组成[6,7]。研究发现,TRIM家族在细胞信号转导、免疫反应以及细胞增殖、分化、凋亡等生物学过程中发挥重要作用[8,9]。现有研究表明,TRIM7除了在抗病毒、抗细菌等免疫反应中发挥重要调控作用外[10-13],其异常表达也参与肝癌、肺癌、肾细胞癌、骨肉瘤等多种肿瘤的发生[14-17]。有意思的是,在不同研究中,TRIM7通过泛素化修饰不同的底物表现出肝癌促进和抑制的相反作用[7],提示TRIM7功能作用的复杂性。然而,肝癌发生中,TRIM7异常表达的调控机制尚不明确。

SP1属于SP/KLF转录因子家族,是第1个被发现的转录因子。正常情况下,SP1分布于体内各种细胞内,通过与富含GC序列的基因启动子区特异性结合,从而调控基因表达、参与调节机体多种生命活动[18]。此外,SP1也参与肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移等肿瘤的发生发展。研究发现,SP1在肝癌、胃癌、乳腺癌等肿瘤组织中表达水平显著高于周围正常组织,且与肿瘤的恶性程度呈正相关[19]。本研究发现,SP1能够直接结合在TRIM7基因启动子上,从而上调肝细胞内TRIM7基因的表达,最终促进肝细胞癌的发生。

1 材料与方法

1.1 材料

胎牛血清(PAN, P30-3302)、DMEM培养基(Gibco, C11995)、青霉素-链霉素双抗(Gibco, 15140-122)、胰酶(Gibco, 25200072)、Trizo(Invitrogen, 15596026)、反转录试剂盒(Vazyme, R101-02)、SybrGreen qPCR Mix(DBI, 2143)、双荧光素酶报告基因检测试剂盒(promega, E1910)、TRIM7抗体(HUABIO,ER1918-12)、β-肌动蛋白(β-actin)(proteintech, 60008-1)、Flag抗体(Sigma, F3165)。

1.2 细胞培养及处理

HEK-293 T、HepG2、和 L02细胞均来自于本实验室冻存。细胞培养在DMEM完全培养基(10%FBS和1%青霉素-链霉素双抗)中,并置于37 ℃、5%CO2的培养箱中孵育。细胞转染实验:细胞密度生长至80%时,采用转染试剂Lipofectamine 2000参照说明书步骤将相应的质粒转入细胞。24 h后,收集细胞进行双荧光素酶活性检测或提取细胞RNA、蛋白质等后续实验。

1.3 肿瘤组织中TRIM7的表达分析

采用TIMER2.0数据库(http://timer.cistrome.org/)中的Gene_DE模块分析TRIM7基因在TCGA数据库中所有肿瘤组织和邻近正常组织中的表达情况;采用ToPP数据库(http://www.biostatistics.online/topp/index.php)的单因素分析程序(univariate analysis)分析TRIM7基因在肝细胞癌(LIHC)中的表达以及肝细胞癌不同阶段的表达分布,其参数设置如下:Select dataset: TCGA-LIHC;Data type: Gene expression;Cutoff: Median;Differential expression: yes。使用GEPIA2数据库和Kaplan-Meier Plotter数据库,分析TRIM7基因表达与肝癌病人总生存时间的关系。GEPIA2数据库参数设置:Gene:TRIM7;Methods: Overall survival;Group off: median;Hazards Ratio (HR): No;95% Confidence Interval: No。Kaplan-Meier Plotter数据库参数设置:Gene symbol:TRIM7;Split patients by: Auto select best cutoff;Survival: OS;Pathology: All;Patient: All。

1.4 三元基序家族蛋白7基因启动子及其截短突变体报告基因载体构建

以HepG2细胞基因组DNA为模板PCR扩增TRIM7基因启动子序列,将纯化的PCR产物(TRIM7启动子片段)与报告基因载体pGL3-basic分别用MluI、Hind III进行双酶切,回收目的片段与载体片段经T4连接酶连接后转化感受态DH5α,并利用含氨苄抗性的平板进行筛选培养。次日挑取单克隆进行菌落PCR鉴定,并挑取阳性克隆送北京擎科生物科技有限公司进行测序鉴定,最后将测序正确的菌落扩大培养、提取质粒pGL3-TRIM7-promoter。含有不同SP1结合位点TRIM7基因启动子截断突变体(PM1、PM2、PM3、PM4)以野生型TRIM7启动子作为模板进行PCR扩增获得,并按上述方法构建到pGL3-basic载体中。

1.5 双萤光素酶活性检测

将生长状态良好的HEK-293 T或HepG2细胞铺至24孔培养板中,待细胞密度达70%～80%时,共转染野生型或突变型TRIM7基因启动子驱动的萤火虫荧光素酶质粒pGL3-TRIM7-pro、SP1表达质粒,所有样品均使用表达海肾荧光素酶的载体pRL-TK作为内参,其中pGL3系列质粒用量每孔为200 ng,pRL-TK用量为20 ng。细胞转染24 h 用裂解缓冲液裂解细胞,根据制造商的说明采用双荧光素酶报告试剂盒(Promega)检测双荧光素酶活性,萤火虫荧光素酶活性归一化为海肾荧光素酶活性,并表现为相对荧光素酶活性。

1.6 实时荧光定量PCR (RT-qPCR)

按照Trizol法从细胞中分离总RNA,随后取出2 μL RNA溶液进行浓度测定以及质量鉴定;随后根据产品说明书,使用HiScript II One Step RT-PCR Kit(诺唯赞)将RNA反转录成cDNA;由RNA反转录的cDNA或者通过ChIP纯化的DNA进行RT-qPCR,采用SYBR Green PCR Master Mix,在CFX ConnectTMReal-Time PCR Detection(Bio-Rad)系统上进行;最后RT-qPCR检测结果采用2-ΔΔCt法分析目的基因表达,其中以β-肌动蛋白作为内参。

1.7 Western印迹分析

将收取的细胞用含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液在冰上裂解30 min,然后将细胞裂解液以12 000 r/min、4℃离心15 min收集上清液,在上清液中加入上样(loading)缓冲液于 95℃金属浴上煮沸15 min,使蛋白质样品变性。将等量的蛋白质样品通过SDS-PAGE凝胶分离并转移到PVDF膜上,封闭后,用一抗在4 ℃冰箱孵育过夜,经洗膜、二抗孵育、再洗膜,用ECL (Millpore)显影。

1.8 染色质免疫共沉淀(ChIP)

将培养的L02细胞用1%(V/V)甲醛交联固定,加入甘氨酸终止交联(终浓度为0.125 mol/L),冷PBS洗细胞并收集细胞,在细胞核裂解缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl pH8.0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA)中裂解细胞,超声打断DNA至大小为400～800 bp。裂解物在4 ℃离心并保留上清,上清液中加入含蛋白酶抑制剂的稀释缓冲液(20 mmol/L Tris-HCL,pH8.0,150 mmol/L NaCl,2 mmol/L EDTA,1%TritonX-100)进行稀释。用洗好的珠子和抗-Flag或对照IgG在4 ℃旋转孵育过夜。清洗珠子后用洗脱缓冲液(0.1 mol/L NaHCO3,1% SDS,30 μg/mL蛋白酶K)在65 ℃过夜,以逆转甲醛交联。随后,用DNA纯化试剂盒纯化DNA,用定量PCR法检测纯化的DNA。

1.9 统计学处理

文章中所有实验结果为3次独立实验代表性结果。实验数据采用SPSS软件进行分析,本研究检测结果以平均数±标准差表示,两样本均数间比较采用Student’st检验,多样本均数间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),以P<0.05为有显著性差异。

2 结果

2.1 三元基序家族蛋白7在肝癌组织中的表达

TIMER2在线软件以及肿瘤在线预后分析诊断平台(ToPP)显示:与正常组织相比,TRIM7基因在多种肿瘤组织中呈现异常表达(Fig.1A),其中在肝细胞癌中TRIM7表达较正常组织明显增多(P<0.001,Fig. 1A,B);并且随着临床上肝癌恶化程度增加,TRIM7表达呈递增趋势(Fig.1C,D)。此外,GEPIA2数据库分析结果显示,在肝癌中,TRIM7高表达的肿瘤患者10年总体生存率明显低于TRIM7低表达患者(Fig. 1E)。Kaplan-Meier Plotter数据库分析结果也显示,TRIM7高表达的肝癌患者预后明显较差(Fig.1F)。以上结果表明,TRIM7基因高表达参与肝癌的发生发展。

2.2 三元基序家族蛋白7基因启动子区转录因子结合位点分析

为了探究肝细胞癌中TRIM7基因表达上调的分子机制,本研究使用UCSC数据库找到人TRIM7基因在染色体上的位置(chr5(q35.3):181193924-181205196, GRCh37/hg38),并分析转录起始位点(TSS)上游1 000 bp及下游170 bp范围内的DNA序列作为TRIM7基因启动子预测序列。此外,本文利用在线网站(https://switchgeargenomics.com/)预测了与上述数据库一致的TRIM7基因启动子序列(Fig.2A)。利用在线软件JAPSAR、HFTarget分析TRIM7基因启动子序列上的转录因子结合位点。结果显示,TRIM7基因启动子的正义链上存在4个SP1转录因子的潜在结合位点 (Fig.2B,C)。

Fig.2 The analyses of transcription factor binding sites in TRIM7 promoter (A) Schematic diagram of TRIM7 gene location; (B) Schematic of the SP1 binding motifs; (C) The related information of SP1 binding sites in the TRIM7 promoter

2.3 转录因子SP1正调控三元基序家族蛋白7基因启动子活性

为了验证转录因子SP1对TRIM7基因表达的调控作用,本研究以肝癌细胞HepG2的基因组DNA为模板,通过PCR扩增获得TRIM7基因启动子预测序列,并将此序列构建至pGL3-basic报告基因质粒中(Fig.3A)。最后,将重组质粒进行DNA测序。测序结果与TRIM7启动子序列进行比对证实,成功构建了pGL3-TRIM7-promoter报告载体并且扩增的启动子序列无突变(Fig.3B)。

Fig.3 SP1 positively regulates the activity of TRIM7 promoter (A) Schematic diagram of the vector of pGL3-Trim7 promoter; (B)The blast results of TRIM7 promoter sequence; (C) Luciferase reporter assays analyzing the effect of different doses of SP1 on TRIM7 promoter activity in HEK293T cells transfected with empty vector or plasmid encoding SP1 (0.1-0.8 μg) for 24 hours,*P < 0.05,**P < 0.01,***P< 0.001 versus control (0 μg) group. (D) Dual luciferase reporter assays analyzing the effect of SP1 overexpression or knockdown on TRIM7 promoter activity in HEK293T cells,***P< 0.001 versus control or si-ctrl group. All data are presented as the mean ± SD from three separate experiments

为了验证SP1对TRIM7基因启动子活性的影响,本文将不同剂量的转录因子SP1表达载体与pGL3-TRIM7-promoter报告载体共转染293 T细胞,进行双荧光素酶活性检测。结果显示:随着转录因子SP1剂量的增加,TRIM7基因启动子驱动的萤火虫荧光素酶活性呈现递增的趋势,约为对照组的1.6～7倍(Fig.3C,D)。相反,沉默SP1显著性抑制TRIM7启动子活性约60%(Fig.3D)。

2.4 转录因子SP1直接结合在三元基序家族蛋白7基因启动子

为了进一步验证SP1通过结合在TRIM7启动子上的SP1结合位点调控其活性,以TRIM7全长启动子为模板,扩增SP1结合位点缺失的截断突变体TRIM7-PM1、PM2、PM3和PM4 (Fig.4A),并将突变体片段插入pGL3-basic报告基因质粒中。将上述构建的突变体报告质粒与转录因子SP1共转染HepG2细胞,进行双荧光素酶活性报告检测。结果显示,随着启动子上SP1结合位点的缺失,SP1介导的启动子转录激活作用明显抑制,甚至完全取消(Fig.4A),提示SP1可能通过TRIM7启动子的SP1位点激活其启动子活性。为了探究SP1是否直接结合在TRIM7启动子上,在肝细胞系L02中利用SP1抗体进行染色质免疫共沉淀,并在TRIM7基因启动子上的SP1结合位点附近设计引物,进行ChIP-PCR检测。结果显示,与IgG阴性对照组相比,转录因子SP1在TRIM7启动子上的SP1结合位点有明显富集(P<0.01,Fig.4B)。以上结果提示,SP1通过直接结合在TRIM7启动子上调控其表达。

Fig.4 SP1 directly binds to the promoter of TRIM7 (A) Graphic scheme of TRIM7 promoter deletion mutant that contains putative SP1 binding sites (left); Luciferase reporter assays analyzing the effect of SP1 on the wild type or mutant of TRIM7 promoter activity in HepG2 cells that transient co-transfected of the wild type or mutant of TRIM7 promoter-reporters with or without SP1 expression vector for 24 hours (right),**P< 0.01,***P < 0.001 versus control group. (B) ChIP-PCR analysis of SP1 binding on the promoter of TRIM7 gene in L02 cells transfected with Flag-SP1,the location of SP1 binding sites in TRIM7 promoter referred to Fig.2A;**P< 0.01,***P< 0.001 versus IgG group. All data are presented as the mean ± SD from three separate experiments

2.5 转录因子SP1促进三元基序家族蛋白7基因表达

上述体外转录活性结果均提示,TRIM7启动子上的SP1结合元件很可能对其转录调控发挥关键性作用。为进一步验证SP1调控TRIM7基因表达,本文将不同剂量的SP1表达质粒转染HepG2细胞,24 h后利用RT-qPCR和Western 印迹方法,分别从mRNA水平和蛋白质水平检测TRIM7基因表达。结果显示,随着SP1表达量增多,TRIM7基因表达呈明显递增的趋势(>2倍)(Fig.5A,B);相反,使用siRNA沉默HepG2细胞内SP1表达,能够显著抑制TRIM7基因表达,抑制效率约为60%(Fig.5C)。使用SP1结合抑制剂Mithramycin A处理过表达SP1的HepG2细胞,Western 印迹结果显示,Mithramycin A呈现剂量依赖性抑制SP1介导的TRIM7基因表达上调,抑制率为40%～60%(Fig.5D)。总之,以上结果表明,SP1可以上调肝细胞内TRIM7表达。

Fig.5 SP1 activates the expression of TRIM7 (A-B) HepG2 cells were transfected with different doses of SP1 (0.25- 4 μg) in 12 well culture plates, and after 24 hours, HepG2 cells were collected for RNA and protein extraction, respectively. RT-qPCR (A) and Western blot (B) analysis the expression level changes of TRIM7 in the above treated HepG2 cells; the representative results of TRIM7 protein were present with the auto exposure time and the long exposure time and marked as TRIM7 (s) or TRIM7 (L);*P<0.05,**P < 0.01,***P< 0.001 versus control(SP1-0) group. (C) HepG2 cells were transfected with two dependent siRNA target to SP1 gene (si-SP1-1 or si-SP1-2) separately, and collected for protein extraction after 24 hours. si-NC was used as a negative control. Western blot analysis of the silence efficiencies of SP1 and the expression of TRIM7 (left panel) as well as the average densitometry of TRIM7 expression relative to β-actin (right panel);**P < 0.01 versus si-NC group. (D) Western blot analysis of the expression of TRIM7 in HepG2 cells transfected with plasmid encoding SP1 followed by treated with indicated dose of mithramycin A for additional 24 hours. β-Actin was used as a loading control (left panel), and right graph shows relative TRIM7 protein level determined by densitometric analysis and normalized to the corresponding β-actin levels. Data are expressed as the mean of three independent experiments;*P<0.05 versus blank control group;#P<0.05,##P<0.01 versus Flag-SP1/ Mith A 0 group

3 讨论

三结构域蛋白质家族(tripartite motif, TRIM)是RING-E3泛素连接酶中最大的亚类之一,在人体中由80多个成员组成,其中大多数TRIM蛋白质由于含有RING结构域而具有E3泛素连接酶活性,并在天然免疫、自噬、细胞增殖和凋亡等多种细胞生命活动过程中发挥关键作用,而一些TRIM蛋白质的异常表达会导致肿瘤在内的各种疾病[20,21]。TRIM7也称为GNIP/RNF90,是TRIM家族蛋白质的新成员,在病毒感染、炎症反应中发挥重要作用[10,11]。现有研究表明,TRIM7的异常表达与多种肿瘤的发生发展密切相关,例如TRIM7在肺肿瘤组织中的表达低于邻近正常组织,且TRIM7表达与肺癌患者的临床分期呈负相关[22]。但另有研究报道也发现,在Ras驱动的癌症模型中,过表达TRIM7增加了肺肿瘤负担,而TRIM7的下调则降低了肿瘤生长[14],提示TRIM7在肺癌发生中其功能的复杂性。此外,TRIM7异常表达与人类胶质母细胞瘤、临床透明细胞肾细胞癌ccRCC等肿瘤发生相关,且与其预后不良具有相关性[17,23]。本文研究发现,TRIM7在肝细胞癌组织中表达上调,并与肝癌的恶化程度呈正相关。Kaplan-Meier Plotter数据库分析结果也显示,TRIM7高表达的肝癌患者预后明显较差。然而,TRIM7在肝癌发生发展过程中的表达调控机制尚不清楚。

SP1作为锌指转录因子SP家族中的一种,对许多启动子中含有GC盒的细胞基因的转录至关重要[24]。一系列的证据表明,在胃癌等多种肿瘤中,SP1出现过度激活,且SP1高表达与肿瘤的侵袭性生物学以及较差的临床预后相关[25],例如,SP1通过与p62基因启动子的GC盒结合激活p62转录,从而降低自噬流促进胃癌发生[26]。本文利用多种在线数据库分析发现,TRIM7基因启动子的正义链上存在4个富含GC碱基的SP1转录因子潜在结合位点,并且利用双荧光素酶报告实验和染色质免疫沉淀实验证实,SP1可以直接结合在TRIM7启动子上的潜在结合位点。此外,在线数据库分析发现,SP1与TRIM7表达在肝细胞癌中具有相关性,并且我们的研究也表明,SP1可以促进肝细胞癌中TRIM7的表达,而SP1结合抑制剂Mithramycin A处理则抑制了TRIM7的表达。总之,以上研究初步揭示了肝细胞癌中TRIM7高表达的调控机制,但未来有必要利用高通量测序技术进一步证实SP1在TRIM7启动子上的结合位点,并利用基因敲除和转基因技术,在体内多种水平验证HCC中SP1对TRIM7基因表达的调控作用研究,从而为深入研究HCC中TRIM7异常表达的病理机制,以及临床工作中肝细胞癌的有效治疗方案的研究提供理论基础。