建立数字PCR检测非小细胞肺癌溶酶体相关的4次跨膜蛋白B基因拷贝数变异方法

王 鲁, 徐国兵, 张青云

(北京大学肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所检验科,恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室, 北京 100142)

溶酶体相关的4次跨膜蛋白B(lysosomal-associated protein transmembrane-4 beta, LAPTM4B)是2000年首次从肝细胞癌中发现、克隆并鉴定的癌基因(NCBI GenBank NM_018407, Gene ID 55353)[10]。现有研究发现,LAPTM4B蛋白在人类正常组织中呈现广泛表达,在肝细胞癌、乳腺癌、胃癌、子宫内膜癌等多种肿瘤组织中呈现高表达,且与患者预后密切相关[11]。我们的前期研究发现,LAPTM4B蛋白的过表达显著增强细胞增殖、侵袭和转移能力,抑制细胞凋亡、启动细胞自噬及介导多重耐药等[12,13]。此外,已证实非小细胞肺癌患者,组织和血清LAPTM4B蛋白水平存在显著升高,适于作为潜在的肿瘤标志物,对患者的诊断及疗效监测具有一定应用价值[14]。但目前尚未有关于肺癌LAPTM4B基因拷贝数检测的相关文献报道。

数字PCR(digital PCR, dPCR)是继实时定量PCR发展的一种绝对定量检测技术,将1个PCR反应分配至2～3万个微小的反应单元中,每个反应单元中包含或不包含1个或多个目标分子。扩增结束后读取各反应单元的阴性或阳性荧光信号进行统计学分析得出拷贝数,不依赖标准曲线实现对样本核酸的绝对定量[15],因其灵敏度及准确度高,抗干扰能力强,已广泛应用于稀有变异检测、拷贝数变异分析及复杂样本基因表达检测。本研究旨在建立一种基于dPCR技术检测基因拷贝数的方法,评估其检测性能,并进一步在非小细胞肺癌样本中评估其临床应用价值。

1 材料与方法

1.1 资料来源

收集2021年3月至2021年7月于北京大学肿瘤医院就诊的NSCLC患者6例,男4例,女2例,平均年龄65(43～74)岁,经病理诊断确诊为NSCLC,收集上述患者的术中冰冻组织,本研究经过北京大学肿瘤医院伦理委员会审查和批准(2020KT20),其研究根据1975年赫尔辛基宣言的伦理准则实施。

细胞株:人肺癌细胞株A549(EGFR野生型)、H1975(携带EGFR T790M和L858R双突变)和HCC827(携带EGFR19外显子缺失突变)均由本实验室保存,细胞株均经过短串联重复序列分析(short tandem repeat analysis, STR)进行鉴定。

1.2 方法

1.2.1 仪器与试剂 QuantStudioTM3D数字PCR系统及超微量分光光度计Nandrop均购自美国赛默飞公司;TIANamp Genomic DNA Kit购自中国天根公司;DNeasy Blood&Tissue Kit购自德国凯杰公司;数字PCR反应液、芯片及内参基因均购自科维思生物科技公司;针对LAPTM4B基因的引物及探针自主设计完成后由金斯瑞生物科技公司合成纯化;细胞培养基DMEM、胎牛血清和胰酶(含EDTA)购自美国赛默飞公司。

1.2.2 基因组DNA的提取 细胞基因组DNA按照TIANamp Genomic DNA Kit(DP304)试剂盒说明书提取,患者冰冻组织DNA按照Qiagen DNeasy Blood&Tissue Kit(69504)试剂盒说明书进行提取,经非接触式超声波破碎仪Covaris M220 将抽提的细胞基因组DNA随机打断成长度为100～300 bp左右的片段;超微量分光光度计Nanodrop测量超碎后细胞基因组DNA片段的浓度及纯度。核酸提取后-80 ℃保存备用。

1.2.3 探针引物的设计 应用Pubmed网站提供的LAPTM4B基因原始序列,利用Primer-Express3.0.1结合参考文献设计。LAPTM4B引物及探针序列如下:上游引物5′-TCAGCAACTCTCCTGT TGGT-3′,下游引物5′-GGGAAAGGTCCTCAGACA CA-3′,探针序列FAM-AGGTTTGCCCACATCCAAGA TGACCT-MGB。采用设计的引物探针建立dPCR反应体系,优化探针引物浓度。

1.2.4 dPCR反应体系的建立 dPCR原理主要依据Sykes提出的基于模板无限稀释及泊松分布的定量检测理论。反应原理正如Fig.1所示,FAM标记的Taqman探针靶向LAPTM4B基因的稳定区域,VIC标记的探针靶向作为参考基因的内部对照基因,使用微流控芯片将微升级别包含样本的PCR反应体系均匀分散至一张带有2万个微孔的芯片内,形成近2万个相互独立的微反应体系,经PCR扩增,检测每个微孔的荧光信号,使用泊松分布计算目的基因与内参基因的拷贝数,二者比值用作确定LAPTM4B基因扩增水平的关键参数。

这种模式主要利用第三方平台作为商品信息的展现渠道，常用的信息发布渠道有微博、微信、QQ空间、抖音等。比较典型的有拼多多，拼多多直接依靠微信等社交网络的覆盖和传播实现客户的裂变转化。另一种常见的做法是邀请网络红人或者KOL在各种社交平台上与粉丝进行互动，利用粉丝的崇拜心理或趋同心理去推销商品。这种方式相当在线上开设专柜，网红或KOL是网上的导购，利用社交网络与客户进行沟通交流达到销售商品的目的。

Fig.1 Design of LAPTM4B detection dPCR assay FAM probe targeted the LAPTM4B gene while VIC probe was designed to target a reference gene. DNA samples were prepared in a master mix and loaded on a chip for dPCR analysis. Wells on the chip containing the LAPTM4B gene target sequence will yield a positive FAM signal; wells containing the reference gene target sequence will yield a positive VIC signal. The ratio of FAM: VIC signal determines the level of LAPTM4B amplification in samples

dPCR预混液配制:7.25 μL Tapman Fast Advanced Master Mix,0.725 μL 250 nmol/L探针、0.725 μL 600 nmol/L PCR上下游引物,0.725 μL RNase P内参基因,5 ng模板(细胞系和组织DNA),无酶水补足14.5 μL终体积,按照标准流程将反应液上样至数字PCR芯片,填充液填充密封上样口。反应条件:预变性96 ℃×10 min,1次循环;退火和延伸60 ℃×2 min,变性98 ℃×30 s,39次循环;终延伸60 ℃×2 min,1次循环,最终降至10 ℃。

1.2.5LAPTM4B基因拷贝数检测方法的性能评估

(1)最低检测限:将阳性细胞株基因组DNA与人类基因组DNA按照不同比例进行混合,得到100%、50%、25%、12.5%及6.25%不同浓度梯度的反应模板,使用建立的dPCR检测方法进行检测。每个浓度梯度进行3个重复实验。

(2)线性评估:分别检测100%、50%、25%及12.5%不同浓度的阳性细胞株DNA,每个样本重复检测3次,分析预期结果与实际检测结果的相关性,各浓度的检测偏差百分比DEV<15%,且曲线的回归系数R2>0.99可判断为线性。

(3)精密度评估:将阳性细胞株基因组DNA与人类基因组DNA按比例混合,得到100%、50%、25%及12.5%的阳性细胞系DNA,对同一样品在同一反应体系条件下重复10次检测,满足CV≤10%认定为此检测方法的重复性较好。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 数字PCR检测体系的建立

以NSCLC细胞株A549(EGFR野生型)、H1975(携带EGFR T790M和L858R双突变)和HCC827(EGFR 19Del突变)为模板,人类基因组DNA作为阴性对照,分别进行dPCR反应,探索建立LAPTM4B基因拷贝数检测体系的可行性。FAM通道为目的基因通道,VIC为内参基因通道,蓝色和绿色,红色和绿色点分别代表目的基因和内参基因的阳性孔,黄色为无扩增阴性孔(Fig.2)。每个样本重复检测2次,结果汇总正如Table1所示。与人类基因组DNA相比,3株NSCLC细胞系的LAPTM4B拷贝数均出现缺失,其中以HCC827拷贝数降低最为明显,且在FAM与VIC通道中,HCC827细胞系扩增结果散点图阴阳性孔位分得最开,荧光强度差异明显,故选择HCC827作为阳性对照评估所建立体系的检测性能。

Table 1 Detection of the copy numbers of LAPTM4B gene in different lung adenocarcinoma cell lines by dPCR

2.2 方法性能评价

2.2.1最低检测限 制备不同浓度梯度的LAPTM4B拷贝数缺失阳性细胞系DNA,按照建立的dPCR反应体系进行最低检测限评估。结果正如Table 2所示,当LAPTM4B基因拷贝数缺失低至6.25%时,其拷贝数无法有效地与对照组人类基因组DNA区分,故此检测体系最低能够检测到12.50%比例的LAPTM4B基因拷贝数缺失。

2.2精密度评估 对预期LAPTM4B基因拷贝数缺失比例为0%、12.5%、25%、50%及100%的DNA样品进行10次重复检测,评估其批间精密度。结果正如Table 3所示,结果分别为4.92%,7.26%,3.73%,3.40%,2.69%,精密度小于10%视为符合要求。

Table 3 Evaluation of the precision of the dPCR assay

2.2.3线性评估 以预期的LAPTM4B基因拷贝数缺失百分比为横坐标,以实际检测LAPTM4B基因拷贝数为纵坐标,进行线性评估。结果正如Fig.3显示,线性关系为Y=-0.5X+0.9795,R2>0.99(P<0.001,n=15),线性关系良好,表明该体系检测结果具有较高的可信度。

Fig.3 Linear evaluation of the dPCR detection platform The diagram showed the linear fit of absolute quantification of the copy number of LAPTM4B gene. Each test was repeated 3 times

2.3 LAPTM4B基因拷贝数检测的临床验证

依据建立的LAPTM4B基因拷贝数检测方法,对6例NSCLC患者冰冻组织进行DNA提取后进行dPCR扩增,4例患者为浸润性腺癌,2例为浸润性鳞状细胞癌,EGFR分型包含野生型,19外显子缺失及21外显子点突变。结果正如Table4所示,病例1～5与健康人基因组DNA相比,均出现LAPTM4B基因拷贝数缺失,这一结果与肺癌细胞系检测结果相符,但病例6却呈现出LAPTM4B基因拷贝数增加,与细胞系结果相反,推测与此例患者术前化疗有关,未来仍需大样本数据进一步研究支持。综上,初步证实自主建立的dPCR方法能有效对临床样本进行LAPTM4B基因拷贝数检测,并具有一定的临床实用性。

Table 4 Copy number detection of LAPTM4B gene in NSCLC tissues by the dPCR assay

3 讨论

本研究首次以芯片式数字PCR为技术平台,成功建立非小细胞肺癌LAPTM4B基因拷贝数检测方法,进行了基本的性能评估,在此基础上,通过组织样本检测,初步证实该方法的临床实用性。

LAPTM4B基因位于人染色体8q22.1,编码III类跨膜分子包含4个跨膜区域,分布于以溶酶体为主的细胞浆内,在人类正常组织中呈现广泛表达。其cDNA全长包含2个翻译起始密码子ATG,可编码LAPTM4B-35和LAPTM4B-24两种蛋白质亚型。已有研究证实,LAPTM4B-35蛋白在多种肿瘤组织中呈现高表达,包括肝细胞癌、乳腺癌癌、肺癌、结肠癌、胆囊癌及卵巢癌等,且与肿瘤进展及患者不良预后密切相关[16-26]。此外,LAPTM4B基因第1外显子5′非翻译区一段19 bp序列存在多态性,导致出现LAPTM4B*1和LAPTM4B*2两种基因型。携带LAPTM4B*2型等位基因人群罹患肿瘤危险性更高,被证实为肿瘤的危险因子之一(OR=1.487, 95%CI 1.339-1.651)[27]。LAPTM4B作为原癌基因有助于EGFR信号通路的持续激活,促进细胞增殖及增强细胞耐药性,同时与非活化状态的EGFR相互作用启动自噬发生。因此,LAPTM4B有望成为EGFR的联合靶分子应用于非小细胞肺癌患者TKI治疗中[28-29]。

目前,针对LAPTM4B基因拷贝数检测的报道较少,仅在路易体痴呆(dementia with Lewy bodies, DLB)患者中发现存在LAPTM4B基因拷贝数缺失,此变异会通过溶酶体途径影响疾病发展[30]。我们的前期研究[14]已明确,LAPTM4B在非小细胞肺癌组织及血清表达水平均显著增高,但其高表达状态是否与基因拷贝数变异有关尚无相关报道。本研究通过芯片式数字PCR技术,成功建立LAPTM4B基因拷贝数检测方法,同时基于优化的dPCR反应体系开展检测限、灵敏度和线性评估,以验证方法的可靠性。研究显示,与LAPTM4B基因高表达状态不同的是,非小细胞肺癌中LAPTM4B基因拷贝数相较正常人出现了显著降低,推测这一结果可能与LAPTM4B的基因调控有关。转录因子特化蛋白1(transcription specificity protein 1, SP1),环磷腺苷效应元件结合蛋白1(cyclic AMP responsive element-binding protein-1, CREB1)及激活增强子结合蛋白4(activating enhancer binding protein 4, AP4)均可结合于LAPTM4B基因启动子区,正向调控其转录水平[31-32, 12-13]。此外,LncRNA可作为竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)与调控LAPTM4B的miRNAs相互作用,正向调控LAPTM4B基因的表达水平,促进肿瘤细胞的增殖及转移[33]。性能评估结果显示,数字PCR作为一种实现单分子级的高灵敏度检测技术,最低可检测到12.5%的LAPTM4B基因拷贝数缺失,同时具有良好的精密度和线性。

应用dPCR检测6例NSCLC患者术中冰冻组织LAPTM4B基因,5例患者均出现了拷贝数降低,但出现1例浸润性鳞癌LAPTM4B基因拷贝数较正常组织升高,可能与该例患者术前接收化疗相关。此外受取材位点,组织异质性等影响也可能导致检测结果的差异。因此,未来应联合ctDNA检测探索外周血LAPTM4B基因拷贝数检测的可行性,实现“液体活检”有效避免组织异质性。此外,在激素受体阴性的乳腺癌患者组织中进行FISH检测发现,LAPTM4B基因拷贝数增加与蒽环类化疗药物反应不佳有关[34]。因此,建立外周血LAPTM4B基因拷贝数检测方法可能对患者化疗疗效进行有效监测。此外,本文注意到在细胞株的检测中,EGFR野生型的细胞株A549的LAPTM4B基因拷贝数明显高于EGFR突变型细胞株,在组织样本中出现基因拷贝数升高的患者EGFR也为野生型,未来需要扩大样本量,探索EGFR突变状态是否与LAPTM4B基因拷贝数存在关联。

本研究首次建立dPCR检测非小细胞肺癌LAPTM4B基因拷贝数检测平台,初步评估该检测方法基本性能和临床应用价值,但入组患者样本过少仍需大样本数据进一步研究。可进一步分析LAPTM4B基因拷贝数与患者临床病理特征及疗效评估间的关系,同时可利用dPCR绝对定量特点动态监测患者基因拷贝数,可能为指导临床治疗方案提供新依据。