全流程规范化条件下石蜡组织FISH技术检测失败的影响因素分析

吕君文,丁 颖,陈旭阳,李 霄,管雅洁,缪 琛,时珊珊,蒋 露,张炜明

荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)技术因具有检测周期短、安全性高等优点[1],在临床病理一线得到了广泛应用,快速准确的FISH报告对患者的诊断及个性化治疗具有重要的指导作用。在实际工作中,FISH技术全流程质控仍未实现,石蜡组织FISH检测失败的情况屡见不鲜。以往的研究多从组织前期处理方法和实验条件两个角度探讨检测失败的影响因素[2-3],在全流程规范化操作且最优的实验流程情况下,检测失败仍时有发生。本研究旨在通过分析江苏省人民医院病理科2018年6月～2022年4月的FISH检测结果,通过统计学方法寻找检测失败的影响因素,分析其可能原因并提出解决方法,以期给广大病理工作者提供更多参考,提高FISH检测的一次成功率。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集江苏省人民医院2018年6月～2022年4月FISH检测病例库中所有FISH检测报告及病例信息合计7 517例,病例信息包含FISH病理号、原病理号、姓名、标本类型、组织名称、病理诊断、报告时间及实验结果评价。删除信息不全、操作条件和本院不同的会诊病例,最终合计5 698例纳入研究范围。

1.2 方法标本前期处理:标本离体30 min内均采用10%中性福尔马林固定,规范化取材,采用全自动脱水仪规范化处理组织(图1)。实验流程:(1)70 ℃培养箱烤片1 h;(2)室温下二甲苯脱蜡3次×10 min;(3)室温下无水乙醇2次×5 min;(4)室温下85%、70%乙醇各3 min;(5)玻片冲水3 min;(6)95 ℃纯水煮片20 min;(7)玻片冲水3 min;(8)37 ℃、2.5 mg/mL胃酶工作液处理10 min,可根据实际情况进行调整;(9)室温下2×SSC液漂洗2次×5 min;(10)70%、85%、100%梯度乙醇中各脱水3 min;(11)参照金普嘉产品说明书配置探针;(12)滴加10 μL探针于组织上,封片,橡皮胶封边;(13)变性:83 ℃ 10 min;(14)杂交:37 ℃湿盒暗处孵育过夜;(15)70 ℃、0.4×SSC洗涤2 min,37 ℃、2×SSC洗涤2 min;(16)室温70%乙醇脱水3 min;(17)复染:滴加15 μL DAPI于组织上,封片。实验由经验丰富的高年资病理技师完成。由一位高年资病理医师和一位高年资病理技师独立阅片,诊断意见一致。以下情况视为实验失败:(1)未见杂交信号(图2);(2)杂交信号弱(图3);(3)荧光背景强,无法分析杂交信号(图4);(4)切片过厚导致细胞核重叠,杂交信号重叠(图5);(5)切片过薄导致信号不完整(图6)。

图1 FISH检测规范化流程图

图2 未见杂交信号 图3 杂交信号弱 图4 荧光背景强 图5 切片过厚导致细胞核重叠,杂交信号重叠 图6 切片过薄,信号不完整 图7 胃癌标本,非特异性吸附强

1.3 统计学分析应用SPSS 25.0软件进行统计学分析。计数资料以例(%)表示,组间比较采用行列表χ2检验进行统计分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FISH检测成功率统计分析显示,本组5 698例FISH检测病例中5 508例FISH检测一次成功,成功率为96.7%;190例FISH首次检测失败(图2～6),失败率为3.3%。

2.2 不同标本来源FISH检测结果本组病例按照标本来源分为常规组3 765例、穿刺组1 303例、快速组630例,FISH首次检测失败病例分别为81例(2.2%)、102例(7.8%)和7例(1.1%)(表1)。统计学分析发现三组间差异有统计学意义(χ2=107.638,P<0.001)。

表1 不同标本来源FISH检测结果

2.3 不同组织类型FISH检测结果本组病例根据组织类型分为乳腺组2 948例、胃肠组461例(图7)、肺组织组119例、软组织组541例、中枢神经系统组562例、头颈组240例、淋巴组404例、其它组423例。FISH首次检测失败病例分别为28例(0.9%)、24例(5.2%)、11例(9.2%)、39例(7.2%)、26例(4.6%)、5例(2.1%)、40例(9.9%)和17例(4.0%)(表2)。统计分析发现,8组间差异具有统计学意义(χ2=153.840,P<0.001)。

表2 不同组织类型FISH检测结果

2.4 不同蜡块年限FISH检测结果本组病例按照蜡块年限分为≤2年组(5 669例)和>2年组(29例),FISH首次检测失败病例分别为188例(3.3%)和2例(6.9%)(表3)。统计分析发现,两组间差异无统计学意义(χ2=1.147,P=0.284)。

表3 不同蜡块年限FISH检测结果

2.5 不同季节FISH检测结果本组病例根据FISH检测时间分为春季组(3～5月)(1 476例)、夏季组(6～8月)(1 623例)、秋季组(9～11月)(1 209例)和冬季组(12～次年2月)(1 390例)。FISH首次检测失败病例分别为52例(3.5%)、60例(3.7%)、39例(3.2%)和39例(2.8%)(表4)。统计分析发现,4组间差异无统计学意义(χ2=2.074,P=0.557)。

表4 不同季节FISH检测结果

3 讨论

已有研究表明组织的前期处理和实验条件等均会直接影响石蜡组织FISH检测成功率[2-4]。为从其他角度探究可能影响FISH检测的影响因素,本研究通过统计学方法分析了5 698例FISH检测结果发现,FISH检测一次成功率为96.7%,失败率为3.3%。该结果表明在本科室规范化的组织处理条件和最优的实验流程下,虽然绝大部分病例FISH检测能够一次成功,但仍存在首次检测失败的情况。本文就可能影响检测的因素进行了研究。

本研究发现不同来源标本之间FISH检测失败率差异有统计学意义,其中穿刺组失败率最高。这可能与部分穿刺组织在未送至病理科前已在固定液中存放过久有关。一方面活检穿刺标本因组织小,固定液渗透快,固定时间一般在4～6 h内,若超出6 h则可能会加剧靶序列与核蛋白的交联程度,使得靶序列暴露困难,探针结合难度增加。另一方面文献报道组织固定后,组织细胞释放的胺与固定剂中的醛结合,会产生可发出荧光的希夫碱,形成背景荧光[5-6],组织固定时间过长可能会加剧背景荧光的产生。非特异荧光过强会掩盖组织特异的荧光信号[6],信噪比降低。遇到这部分穿刺样本,和临床及时沟通,给固定时间“做减法”,给消化时间“做加法”是非常必要的。

组织因其自身的结构特点不同也可能影响FISH检测结果。本研究发现不同组织类型间FISH检测失败率差异有统计学意义。失败率较高的组织分别为淋巴组织、肺组织、软组织和胃肠组织。(1)淋巴组织疾病镜下细胞数量多,排列紧密,切片厚度应控制在2 μm,过厚则会导致细胞堆叠。日常实践中,虽然切片机会定期校准,但蜡块温度、切片速度、切片压力、刀的角度、仪器的润滑程度均会影响切片厚度,导致成片厚度与理想厚度产生一定误差[7]。切片过厚不仅会影响消化的效果进而影响探针结合,而且极易造成细胞聚集,影响信号判读[8-9]。(2)切片厚薄程度对软组织肿瘤FISH检测也同样重要。在脂肪瘤与脂肪肉瘤的诊断及鉴别诊断中,脂肪细胞排列稀疏、细胞间可见脂肪母细胞,其胞质内富含脂滴,呈空泡状。若切片太薄,镜下肿瘤细胞数量过少、核过小则会影响FISH信号的呈现[8]。此外,脂肪细胞内脂滴的存在不利于有机溶剂的渗透,尤其在溶剂反复使用后会影响脂肪组织的处理效果[10]。因此对于带有脂肪的肿瘤,取材时可将组织取的相对薄一点,以便组织得到充分处理,有利于降低FISH检测失败风险。(3)一些软组织肿瘤中存在黏液成分,如黏液型脂肪肉瘤具有明显的黏液样基质,黏液纤维肉瘤中含黏液等。如果消化不到位,这些黏液成分会影响探针穿透细胞核和靶序列结合,增加FISH检测失败风险。同样地,某些胃肠肿瘤及肺肿瘤中,如黏液腺癌的肿瘤细胞会产生大量黏液样物质,镜下非特异性吸附强,严重干扰正常信号的判读。本研究证明了以上观点,本组中上述组织的失败率均较高。针对带有黏液的组织,可以参考HE切片寻找肿瘤细胞的位置,有针对性的消化切片,防止消化不足或消化过度。

本研究发现4个季度之间FISH检测失败率无明显差异,目前尚无相关文献报道环境温度和湿度对FISH检测的影响,后续需要以客观的温度和湿度来划分范围进行深入的研究。有文献表明蜡块经过长期保存后FISH杂交效率显著下降[11],但本研究中不同蜡块年限之间FISH检测失败率差异无统计学意义,这可能与本组年限较长的蜡块例数较少有关,后期可扩大样本进一步研究。

综上,样本的差异性对其FISH检测成功率具有非常重要的影响,考虑不同标本来源及组织特点匹配合适的实验处理步骤至关重要,这要求处理“个性化”标本时,应采取“精准化”的流程,也给广大病理工作者提出了更高的要求。在实际工作中,病理技术员要积累更多的工作经验,为全流程质控的实现提供基础,进一步提高FISH检测成功率。