无典型病变心源性猝死的法医病理学研究进展

陈燕枝,于海胜,汪 炜,李 萱,张可丽,方义湖

心源性猝死(sudden cardiac death, SCD)是指由各种心脏原因引起的自然死亡,其特点是发病突然、进展迅速、死亡发生在症状出现后1 h内。SCD常见的病因有冠状动脉病变(如冠心病)、心肌病变、心脏瓣膜病、先天性心脏病等[1]。早期心肌缺血(early myocardial ischemia, EMI)指猝死者在心肌缺血发生后6 h内死亡,无典型病理变化。致命性心律失常、冠状动脉痉挛导致的SCD,通常亦无典型心脏及血管病理变化,常较难发现,如何准确、客观地诊断无典型病变SCD一直是法医学领域的难题。尸检数据表明,大多数SCD冠状动脉病变并不十分严重,心肌缺血损伤不明显,某些病理改变似乎不足以引起心肌梗死[2-4]。目前,SCD的法医诊断主要依据冠状动脉及心脏的形态学变化,包括冠状动脉病变、心肌组织改变、各器官是否淤血等。对无明显冠状动脉和心肌病变的病例,主要通过排除其他死亡原因(如机械性窒息、急性中毒等)来做出诊断[5]。在实际法医鉴定工作中,许多SCD与异常窒息、溺水、急性中毒、药物过敏等的鉴别困难,血液生化指标检测、形态病理学检查和免疫组化检测等综合应用可显著提高无典型病变SCD诊断的客观性、准确性和可靠性。本文对生物化学标志物、病理学形态、组织特殊染色技术和免疫组化在无典型病变SCD法医学诊断中的用途、特点和局限性进行综述,旨在提高无典型病变SCD法医病理学诊断的客观性、准确性。

1 生化指标检测

心肌细胞损伤表现为轻度和重度,前者是可逆的,主要表现为心肌细胞膜的通透性发生改变,心肌细胞胞质中可溶物质,如肌红蛋白(Mb)和肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)渗透至心肌细胞外[6]。当心肌持续性损伤,心肌细胞的肌原纤维出现损伤,就会变成重度损伤,即不可逆的心肌细胞坏死,这时可导致肌钙蛋白(cTn)等肌原纤维蛋白成分从心肌细胞中流出[7]。因此,检测心肌细胞质的可溶性成分和肌原纤维蛋白成分,可以反映心肌损伤的程度和性质[8]。cTn的特异性较高,在急性心肌梗死发生4～8 h后血液中cTn逐渐升高,8～16 h达到高峰。Mb在急性心肌梗死时出现最早,4～8 h达到高峰,24 h后可恢复到正常。需注意的是,严重的休克、广泛的创伤、心肌炎、急性感染时,Mb也可以升高。

1.1 CK-MBCK-MB曾被认为是诊断心肌梗死的“金标准”,已广泛应用于心肌梗死的临床诊断。研究表明[9],在机械性创伤、一氧化碳中毒、冰毒中毒等解剖病例中,心脏和外周血中均可检测到CK-MB升高,表明CK-MB对心肌细胞的特异性作用相对有限。

1.2 cTnTcTnT是一种完全心肌细胞特异性钙调蛋白,仅少量存在骨骼肌,可作为心肌梗死诊断的首选标志物。Zhu等[10]发现,尸体血清(左右心腔、外周血)和心包液中cTnT的升高程度取决于死亡时心肌坏死范围,同时与死亡时间有关,死亡后12 h血液和心包液中cTnT浓度低于死后12～48 h。

1.3 cTnIcTnI是心脏肌原纤维的结构蛋白,被认为是心肌坏死的“金标准”,可以检测微小的心肌损伤[11]。当心肌细胞膜完整时,cTnI不能或较少能穿透细胞进入血流;而当心肌细胞缺血或坏死,cTnI可能会大量释放到血液中。

1.4 心脏脂肪酸结合蛋白(H-FABP)H-FABP是一种低分子量蛋白质,参与心肌的脂肪酸代谢,其可以评估疾病的预后。研究证实,H-FABP水平与患者10个月内发生死亡、心肌梗塞或心力衰竭等心血管事件的可能性呈正相关[12]。H-FABP和cTn联合应用,可能会提高SCD的预测价值。

1.5 B型钠尿肽(BNP)BNP是心室肌细胞分泌的一种蛋白,在心衰的诊断中有重要价值,EMI时存在BNP mRNA升高;检测BNP mRNA可能对鉴别冠状动脉性猝死和过敏性休克死亡有帮助[12]。

这些标志物单一使用可能会存在一些局限性,联合使用具有灵敏度高、特异性强、持续时间长等特性。孙进广等[13]观察20例心肌梗死患者死后4项血液生化指标LDH、cTnI、CK、CK-MB逐渐升高,有助于心肌梗死的诊断及死亡原因鉴定,对早期缺血性心肌病导致的SCD诊断有帮助。中国医科大学[14]公布了一项发明专利,通过检测尸体心包液中CK-MB、cTnT、NTproBNP三项生化指标,与截断值进行比较,用于鉴定缺血性心脏病导致的SCD,此发明可以提高法医学鉴定SCD的准确率,具有重大意义。Wang等[15]发现,与单独使用hs-cTnI相比,联合使用hs-cTnI和NT-proBNP对有胸痛症状患者的急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)预测效果更好。

2 大体标本染色法

心肌缺血梗死6 h后出现肉眼可见形态学变化,无典型病变SCD通常无明显的形态学改变。氯化三苯基四唑(TTC)[16]是呼吸链吡啶和核苷结构酶系统的质子受体,其与正常组织中的脱氢酶反应生成脂溶性红色甲臜;而在缺血组织中脱氢酶活性降低,无法与之反应,所以不会有任何变化,表现为苍白色,TTC染色法在形态学改变不明显标本中,广泛用于测定心肌梗死面积[17]。硝基蓝四氮唑(NBT)染色法浸染心肌组织,缺血、梗死区呈黑色改变,在心肌组织缺血发生3 h内即出现阳性结果,该方法简单、灵敏[18]。

3 HE染色

心肌组织在缺血缺氧损伤条件下,细胞功能代谢形态发生一系列变化,根据损伤程度表现为可逆性损伤和不可逆性损伤。早期主要以细胞质嗜酸性改变为主要特征,胞质颗粒变、细胞肿胀;梗死后2 h,心肌纤维变为波纹状,肌质不均;随后坏死心肌收缩带和坏死心肌纤维灶出现[19]。这些病变特征为诊断SCD提供依据,但EMI、致命性心律失常、冠状动脉痉挛导致的SCD因发病时间短暂,法医鉴定标本保存方法及时间的不确定性,通常HE染色难以观察到有特征性的形态学改变。

4 组织化学特殊染色

组织化学特殊染色是较早用于心肌缺血死后诊断的方法,与免疫组化相比其更经济实惠,对于无典型病变SCD具有重要指导意义,即通过特定的染料和方法对正常心肌和缺血心肌组织的着色能力不同而呈现不同的结果。在法医鉴定实践过程中,本团队常用的特殊染色是铁矾-苏木精-伊红(Heidenhain)染色法,将切片脱蜡媒染于5%硫酸铁铵,苏木精染色,5%硫酸铁铵分化(镜下控制到正常心肌纤维无色为止),伊红染色。Heidenhain染色示正常心肌细胞胞质呈红色,胞核呈灰色,缺血损伤心肌呈灰黑色[20]。刘英坤等[21]在心肌缺血的早期诊断中采用Heidenhain染色,结果显示其能将冠心病猝死的缺血心肌染成黑色,且染色效果优于HE、苏木精-碱性复红-苦味酸染(HBFP)染色。刘晓宇等[22]研究Heidenhain染色在缺血性心脏病猝死诊断中的应用价值,结果表明Heidenhain染色在诊断CAD-SD中具有较高的敏感性和特异性。毕海涛等[23]通过对HBFP染色、变色酸2R-亮绿染色和Heidenhain染色进行比较,结果显示,Heidenhain染色对于早期缺血心肌组织具有更高的稳定性和可操作性。朱育连等[20]分别对组织样本进行HE染色、HBFP染色和Heidenhain染色,结果表明,Heidenhain染色可以清晰显示EMI的形态变化,着色面积持续稳定的扩展呈片状和团块状分布。因此,Heidenhain染色与HBEP染色、变色酸2R-亮绿染色等多种特殊染色法相比,对于无典型病变早期缺血心肌组织的染色具有稳定、准确、操作简单、实用等特点,对无典型病变SCD的诊断及鉴别诊断具有重要指导意义。

5 免疫组化染色

心肌组织缺血至坏死呈现动态的病理变化:(1)心肌细胞膜损伤和通透性改变;(2)血浆中的特定成分通过受损的毛细血管壁进入细胞间隙,黏附进入到心肌细胞内;(3)受到缺血和缺氧刺激,心肌细胞快速合成特定蛋白质分子(正常情况不表达或低表达)[24]。基于以上三个方面,SCD常用的免疫组化检测包括细胞标志物:cTnI、cTnT、actin(HHF35)、H-FABP、S100A1、缝隙连接蛋白(Cx)、Mb、CD59、desmin等;血浆标志物:纤维蛋白原(Fg)、纤维连接蛋白(Fn)、补体(C5、C9、C5b-9等);缺血心肌诱导表达标志物:HIF-1α、HIF-2α、VEGF、内皮素(ET)、TGF-β1、聚集素蛋白(CLU)、含凝血酶敏感素基序的解聚素样金属蛋白酶(ADAMTS)等[24]。这些免疫组化标志物在EMI组织、无典型病变心肌组织中均具有敏感性、特异性,随着心肌坏死时间的延长可达到高峰。心肌缺血的免疫组化指标能否用于法医病理学实践工作,取决于其特异性和敏感性及组织自溶、腐败等因素对所检测抗原的影响,也必须予以考虑。胡丙杰等[25]观察EMI中死后诊断指标desmin、actin(HHF35)、Mb受死后自溶影响,稳定性较差,这些指标仅适用于新鲜尸体。熊小明等[26]发现心肌标本置于4 ℃保存后,正常心肌组织和缺血心肌组织中cTnT阳性随着保存时间的延长而趋于下降,14天后完全消失,仅在4 ℃下1～7天内缺血心肌与正常心肌之间cTnT阳性反应有明显差异。毕海涛[24]通过不同尸体保存条件对免疫组化标志物的影响显示actin(HHF35)、H-FABP及S100A1稳定性最差,C5b-9、Fn、CLU、HIF-1ɑ、HIF-2α、ADAMTS-1均显示出良好的稳定性。龚超[27]通过与正常心肌、疑似梗死区对比显示H-FABP和actin(HHF35)对心肌梗死的诊断特异性最差,不宜作为单独诊断心肌梗死的诊断指标,CLU、Fn、C5b-9、HIF-1α和ADAMTS-1对心肌梗死的诊断价值较高,但也可在休克、煤气中毒、电击死亡等案例死亡者中表达。

鉴于法医实践中案件的复杂性,不仅要考虑到免疫组化指标的敏感性、特异性,还需考虑到尸体保存及组织自溶等一些不可避免的因素。因此在法医实践过程中,我们力求寻找相对稳定且敏感的指标,同时将多种标志物联合应用于SCD的死后诊断,尤其是无典型病变SCD的死后诊断。刘志峰等[28]在43例病理尸检标本中检测到细胞因子信号转导抑制分子-1(SOCS-1)和原癌基因蛋白(C-JUN),结果显示SOCS-1和C-JUN均高于对照,且SOCS-1和C-JUN的表达量呈正相关,两者均可能参与SCD的发病机制,可作为法医学鉴定SCD的重要指标。Cao等[29]研究结果表明,BNP的分子病理学可用于SCD的终末期心功能测定,并在法医实践中分析其致死机制。李国良等[30]选择20例因心血管系统疾病猝死者的心脏标本,观察SCD心肌组织中miR-17、HIF-1α和STAT3的表达水平,结果显示miR-17和HIF-1α高表达,STAT3弱表达,HIF-1α和STAT3联合使用将成为诊断SCD的客观指标。

6 其他检测技术的应用

6.1 傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)成像技术和红外图像分析技术FTIR与红外显微镜技术的联用,即FTIR成像技术,实现了将显微观察与红外光谱测定的有机结合,又称分子化学光谱成像技术,利用光谱成像软件,收集捕获人体细胞组织中核酸(DNA和RNA)、蛋白质、双层磷脂膜等聚合物,形成不同像素的光谱信息[31-33]。红外图像分析技术是在FTIR成像技术基础上发展起来的微区分析技术,通过红外图像的不同色差来区分不同的组织细胞,能直观显示组织病理改变。建立组织光谱成像图和组织病理的关系,最终用于疾病的分子诊断。郑娜等[34]收集20例因缺血性心脏病猝死者(均含有陈旧性心肌梗死病灶)的心脏样本,检测分析显示梗死区心肌频谱大于邻近非梗死区峰高Ⅰ/酰胺Ⅱ峰高增加,酰胺Ⅲ吸收峰出现峰位置、峰展宽和峰强度蓝移下降,说明与未损伤心肌组织相比,心肌梗死后陈旧组织的蛋白质含量和成分各不相同。Titus等[35]招募疑似急性冠脉综合征患者,采用红外光谱成像技术无创检测cTn表达水平。

6.2 基于尸体影像学检查的法医虚拟解剖技术随着医学影像技术的发展,为法医检查提供了一种无创/微创的尸检方式——法医虚拟解剖技术,该技术采用数字成像技术,主要包括CT和MRI作为主要诊断手段,获取尸体表面和内部的详细成像数据,由放射科医师创建完整的三维图像,然后由法医通过图像分析检查骨骼、软组织、气管和血管,寻找死亡原因和方式的线索[36]。此前即有将尸检CT血管造影(postmortem CT angiography, PMCTA)和尸检磁共振成像(postmortem magnetic resonance imaging, PMMRI)用于AMI死后诊断的报道[37]。Grabherr等[38]和Saunderst等[39]先后建立了死后血管的PMCTA测试方法成像基础知识。Michaud等[40]使用该技术研究了23例缺血性心脏病死亡尸体,78%(18/23)冠状动脉发生钙化,与传统CT相比,其更易显示病变血管的狭窄或闭塞程度,该技术是显示死后冠状动脉形态学的有效工具,并且Michaud等[41]最近提出尸检成像技术(postmortem imaging, PMI)的侵入性技术,在图像引导下进行心肌或主动脉活检,进一步完善心血管系统疾病导致的死亡后诊断。

Jackowski等[42]利用PMMRI技术发现,20例SCD病例中,19例有心脏损伤,其中13例经后续组织学检查(慢性、亚急性和急性梗死)证实;余6例肉眼观察和组织学检查均未发现阳性结果,但PMMRI检测到超急性损伤。这一研究结果表明PMMRI技术可检测慢性、亚急性和急性病变,可能揭示传统组织学无法检测到的心肌超急性缺血性损伤。PMMRI技术被证实可以检测冠状动脉中形成的血栓[43];Ruder等[44]进一步研究发现,在心肌梗死的PMMRI研究中,化学位移伪影的出现是检查血管开放的标志,而双暗带(成对的暗带)现象表明检查的血管变窄,这一发现将被有助于提高PMMRI对AMI病例的死亡后诊断能力。马龙达等[45]通过CT虚拟解剖与尸检结果对比分析3例,发现在交通事故死亡案例中,两者结论较为一致:在SCD情况下,虚拟解剖提供的信息价值有限。该研究表明,虚拟解剖在交通事故案件中具有较高的应用价值,在SCD病例的鉴定方面仍有改进的空间。

6.3 蛋白质组学技术1994年澳大利亚科学家Wilkins和Williams提出了“蛋白质组学”这一名词。蛋白质组学(pro-teomics)是蛋白质组概念的延伸,是在一般水平上研究蛋白质组学的性质、结构、功能和运作的科学。随着人类基因组计划的结束,生命科学进入了一个新时代,后基因组时代,蛋白质组学逐渐成为功能基因组研究的主要内容之一[46-47]。蛋白质组学研究手段有双向电泳技术、质谱技术、生物信息学技术、蛋白质芯片技术等,Zhang等[48]采用质谱技术发现结扎大鼠冠状动脉15 min后血清中即出现7 564、7 586 Da两个特异性的蛋白峰,而缺血心肌组织中则出现6 304、8 337、8 376 Da三个特异性的蛋白,它是最早检测到的蛋白质标志物,有望用于临床心肌缺血的早期诊断和法医学SCD的诊断。Wang等[49]鉴定了一系列在线粒体功能障碍和代谢途径中起关键作用的蛋白,这些蛋白在AMI心肌代谢重塑中的作用有待进一步研究。越来越多的蛋白标志物被发现,为寻找新的免疫组化指标为SCD法医诊断提供理论依据,蛋白质组学技术也更多、更系统的应用于法医学研究当中。

7 结语

SCD的诊断对于临床和法医学都具有重要意义。SCD发生突然,原因多样,猝死机制复杂,尤其在心脏及冠状动脉无明显病理变化的猝死案例中一直是法医实践过程中的难点,单纯依靠尸检和简单的病理学方法确定死因非常困难并缺乏说服力。结合我国冠心病患者冠状动脉病变程度较欧美国家轻的特点,青年SCD案例不断增长、法医实践等情况,如果尸检显示死者冠状动脉狭窄不明显,心脏无明显的病理改变,可将不同的检查方法系统化用于法医工作,检测敏感稳定的生物化学标志物、应用大体标本染色法、仔细寻找HE染色病变特征,辅助组织化学特殊染色技术、联合特异性免疫组化标志物检测等,在充分排除暴力、中毒和其它自然疾病导致死亡后,结合案情可诊断为SCD。