SDH、NADH-TR染色在先天性巨结肠中的应用及临床意义

王凌燕,张丽丽,任会强,白玉坤,张 萌,安会波

先天性巨结肠(hirschsprung’s disease, HD)为小儿外科常见的消化道畸形,发病率为新生儿的1/5 000,是由于肠神经系统胚胎期发育障碍引起的远端肠管黏膜下及肌层无神经节细胞[1]。目前,其发病机制尚未完全明了。病理诊断方法包括HE染色、酶组织化学染色、免疫组化染色等,但各染色方法均存在不足,研究新的染色方法对HD病理诊断具有重要意义。本实验应用SDH、NADH-TR染色,同时结合HE和免疫组化S-100、Calretinin染色对HD进行病理诊断,并探讨其潜在机制。

1 材料与方法

1.1 材料收集2019年9月～2022年11月临床诊断为HD的术中冷冻组织69例及对应手术切除肠管标本69例(其中手术切除肠管标本中38例为新鲜标本,先部分取材用于SDH、NADH-TR染色,再将剩余标本固定;余31例肠管标本术后直接固定)。患儿年龄2个月～4岁,中位年龄6个月,男童54例,女童15例。所有切片均经两位高年资病理医师复核。

1.2 试剂与方法(1)收集HD术后新鲜肠管标本38例,分段取材,OCT包埋剂包埋,将盛有异戊烷的小烧杯放入装有液氮的大保温杯中,待装有异戊烷的小烧杯内杯底及周壁出现白色糊状,将组织冰托放入小烧杯中,约20 s取出,用Cryotome PSE型恒冷切片机(美国Thermo公司)在-20 ℃下3 μm厚切片,黏附于载玻片上,进行SDH、NADH-TR染色,切片置于染色液中37 ℃孵育40 min,蒸馏水冲洗,甘油明胶封固。其中SDH染色液配制方法:0.2 mol/L琥珀酸钠5 mL+0.2 mol/L磷酸缓冲液5 mL+NBT(氯化硝基四氮唑兰)10 mg,搅拌至完全溶解;NADH-TR染色液配制方法:Tris-HCl 20 mL(pH 7.4)+NBT(氯化硝基四氮唑兰)20 mg+NADH CoI还原型16 mg,搅拌至完全溶解。(2)69例冷冻组织和对应手术切除标本经10%中性福尔马林固定,分段取材,行HE和免疫组化S-100、Calretinin染色,S-100、Calretinin抗体购自北京中杉金桥公司,免疫组化染色采用EnVision法。

1.3 结果判读S-100、Calretinin阳性定位于细胞质或细胞核,以细胞质或细胞核内出现棕黄色、黄色时为阳性,Calretinin表达于神经节细胞,不表达于无神经节细胞的神经纤维,S-100同时表达于神经节细胞及神经纤维,在神经节细胞中呈“空泡状”,在神经纤维中均匀着色。当神经纤维束最大径≥40 μm时定义为粗大神经纤维。SDH、NADH-TR染色在神经节细胞的细胞质内呈颗粒状蓝色,细胞核不着色,神经纤维呈均匀蓝色。

1.4 统计学分析所有数据采用SPSS 23.0软件进行统计学分析。采用χ2检验或Fisher确切概率法进行相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HD中HE染色本组术中冷冻组织狭窄段HE染色见粗大神经纤维69例,均未见神经节细胞。术后切除石蜡标本狭窄段见粗大神经纤维69例,其中偶见神经节细胞2例,冷冻与石蜡组织符合率97.10%。冷冻组织扩张段肌间见神经节细胞者65例,4例扩张段未见明确神经节细胞,再次送检见神经节细胞。术后石蜡组织切除标本扩张段见神经节细胞69例,其中5例偶见粗大神经纤维,冷冻与石蜡组织符合率为92.75%。

2.2 HD中S-100、Calretinin的表达术后切除标本免疫组化染色显示,S-100在肌间粗大神经纤维中68例呈阳性(68/69,98.55%),在肌间神经节细胞中67例呈“空泡状”阳性(67/69,97.10%);Calretinin在肌间神经节细胞中表现为细胞质及细胞核不均匀阳性(67/69,97.10%),在部分肌间粗大神经纤维中表现为点灶状阳性(2/69,2.90%)。

2.3 HD中SDH、NADH-TR染色本组收集术后切除新鲜肠管38例行SDH、NADH-TR染色,SDH染色显示粗大神经纤维呈均匀淡蓝色(37/38,97.37%)(图1),肠壁肌间(图2)和黏膜下(图3)神经丛内间质呈均匀淡蓝色,神经丛内神经节细胞胞质呈细颗粒状深蓝色,细胞核不着色(36/38,94.74%)。NADH-TR染色中粗大神经纤维呈均匀蓝色(36/38,94.74%)(图4),肠壁肌间(图5)和黏膜下(图6)神经丛内间质呈均匀蓝色,神经丛内神经节细胞胞质呈细颗粒状深蓝色,细胞核不着色(37/38,97.37%),且组织NADH-TR染色较SDH深,不同发育阶段的神经节细胞胞质着色面积不同。

2.4 HD中各染色之间的相关性分析在粗大神经纤维染色中,S-100、SDH、NADH-TR染色的阳性率分别为98.55%、97.37%、94.74%,各组间差异无统计学意义。在肌间神经节细胞中,S-100、Calretinin、SDH、NADH-TR染色的阳性率分别为97.10%、97.10%、94.74%、97.37%,各组间差异无统计学意义。

3 讨论

HD患儿结肠远段黏膜下及肌间神经丛中的神经节细胞缺如,形成“肥大神经丛”结构。研究认为其与神经嵴干细胞的迁移、发育、存活异常有关[1],也有研究认为,肠道神经节细胞的不足可以通过局部神经嵴细胞的增殖和分化来代偿[2]。细胞增殖所需的能量主要由线粒体内有氧呼吸提供。线粒体还参与细胞分化、细胞信号传递和细胞凋亡等过程,并拥有调控细胞生长和细胞周期的能力。因此,观察线粒体酶的表达对研究HD的神经节细胞缺如与能量代谢之间的关系有重要意义。本实验应用SDH、NADH-TR两种酶组织化学法进行观察,其中SDH为线粒体三羧酸循环的关键酶,是连接氧化磷酸化与电子传递的枢纽之一[3];可作为三羧酸循环运行强度的检测指标[4]。NADH定位于线粒体中,为有氧代谢电子传递链中的酶,作为供氢体,可反应三羧酸循环、细胞色素系统和其他氧化代谢途径的利用情况[5]。NADH-TR染色使无色的四唑盐还原为不溶性的蓝紫色,在线粒体上沉淀下来,使线粒体染成深蓝色,染色的深浅可显示线粒体内NADH脱氢酶含量的多少[6]。此前上述两项组织化学染色常用于神经肌肉组织活检诊断中。有研究表明HD狭窄段SDH活性升高[7];国内外文献尚未见NADH-TR在HD组织标本中的报道。

由于婴幼儿肠神经节细胞发育未成熟,缺乏典型的细胞形态,且在合并结肠炎时淋巴单核细胞与神经节细胞不易鉴别,易导致误诊。因此,目前HD术中冷冻病理诊断多采用HE染色联合乙酰胆碱酯酶(AchE)、甲苯胺蓝等酶组织化学染色法进行诊断。HD术后最终诊断需经石蜡包埋切片,采用HE染色与免疫组化染色相结合,抗体包括NSE、S-100、PGP9.5、Calretinin等。然而,各染色方法并非完美,如HE染色可鉴别神经丛内有无神经节细胞,但对于涉及细胞分化和功能改变的观察有限[8]。研究发现AchE既存在于胆碱能神经元,也存在于非胆碱能神经元,假阳性率较高[9]。甲苯胺蓝染色可显示神经节细胞内尼氏体的数量,并且观察尼氏体的数量和形态能反应神经节细胞的成熟程度和功能。但其对粗大神经纤维的判断并无特异性[10]。S-100蛋白在狭窄段神经节细胞缺失区域可见强阳性的增粗神经纤维[11],而在HD扩张段神经节细胞区域可见“空泡状”表现,本组中68例肌间粗大神经纤维呈强阳性,67例神经节细胞呈“空泡状”阳性;但当取材深度不够时,可能见不到S-100阳性的粗大神经纤维导致漏诊。本组中8例扩张段冷冻组织中未见粗大神经纤维,但术后切除扩张段肠壁组织中见粗大神经纤维,且1例粗大神经纤维S-100呈阴性。Calretinin在神经节细胞中阳性,而在神经节细胞缺失的神经纤维中阴性[12]。近期有学者提出Calretinin阳性神经纤维可以延伸至无神经节细胞肠段,因此短段型肠无神经节细胞症直肠黏膜活检Calretinin染色出现阳性神经纤维时应警惕假阳性[13]。本组有2例Calretinin染色见阳性神经纤维。由此可见,S-100、Calretinin染色也存在一定的假阳性与假阴性。因此,一些病理学家主张HD的术前诊断应在HE染色的同时必须有其他染色方法共同诊断,以保证诊断的准确性,但是应用酶组织化学还是免疫组化尚未统一[14]。

本实验对临床及冷冻诊断为HD的新鲜肠管组织,进行SDH、NADH-TR酶组织化学染色,应用异戊烷-液氮快速冷冻法冷冻组织,恒温冷冻切片进行染色。异戊烷-液氮快速冷冻的优点在于:首先避免了冷冻造成的冰晶、空泡,其次避免了石蜡包埋引起的酶活性失活。此冷冻方法可应用于HD术中冷冻组织中。本实验发现SDH、NADH-TR染色均能清晰地显示神经节细胞的细胞质形态和数量,且对比鲜明,能较准确判断神经丛内神经节细胞的数量和结构,对研究神经节细胞的线粒体酶分布情况提供新思路。同时,可以准确区分粗大神经纤维及不同发育节段的神经节细胞。SDH与NADH-TR染色对于粗大神经纤维及神经节细胞的染色阳性率与S-100、Calretinin相比差异无统计学意义,且染色更清晰,非特异性着色少。

总之,SDH与NADH-TR具有染色方法简便、快速、试剂配制简单、实验条件易于控制等特点,适用于术中快速冷冻切片检查,为HD的病理诊断提供新的检测方法。