减氮配施有机肥对燕麦土壤细菌群落特征影响与生态功能预测

郑敏娜，邹璨阳，康佳惠，杨 富

（山西农业大学 高寒区作物研究所，山西 大同 037008）

燕麦（Avena sativaL.）为1 年生禾本科粮饲兼用型作物，在全球42 个国家和地区广泛栽培，居世界谷物生产第6 位，主要分布于欧洲、亚洲和非洲的温带地区[1]。我国是燕麦的起源地之一，主要分布在华北、西北和西南等地区。燕麦具有耐贫瘠、耐盐碱、耐寒、抗旱、抗风沙等特点[2-3]，适应性广泛，且栽培措施简易，在营养价值、生产性能、利用方式、开发潜力等方面优势突出，是山西省传统优势杂粮作物之一，尤其是大同地区的特色优势杂粮作物，很受市场的青睐，具有很大的发展空间和利用潜力，在山西区域经济建设中发挥着重要作用。

施肥是燕麦田间管理中非常重要的措施之一，对燕麦田生产力的提升和土壤生态具有重要作用。肥料（包括无机肥和有机肥）输入土壤后，会对土壤生态环境产生巨大影响，合理施用不但可以直接提升作物产量，而且可以改变土壤微生态，有利于土壤微生物的正向演替；但在实际生产中，为了追求更高的产量，化肥施用量偏高，有机肥投入不足，造成土壤质量下降等问题，不但造成了土壤资源严重污染，而且会威胁食品安全[4]。因此，在燕麦生产过程中，探索合理的减氮配施有机肥比例，将有利于促进土壤和生产的可持续发展，对晋北地区燕麦田土壤生态系统的可持续发展具有重要意义。

在土壤生态系统中，微生物是重要的参与者，其对土壤养分循环、能量流动和物质转化等起到至关重要的作用[5-9]，是生态系统健康可持续发展的重要保障。在土壤生态系统中，相同的微生物种群可以行使不同的土壤功能，相同的土壤过程也可由不同微生物种群完成，其种群会因环境变更或管理分异产生微生物多样性及其生态功能的变化[9]。目前，众多学者在施肥与土壤微生物及其生态系统方面进行了大量研究，大多试验结果都表明，配施一定比例的有机肥料后土壤微生物量碳、氮、磷和生物活性均有不同程度的提高，具体效果会因配施比例或施肥种类而有所差异[10-14]。然而，也有研究显示，长期氮磷肥配施对土壤微生物生物量的影响不大[15]。

本研究通过田间小区试验，研究在不同剂量无机有肥料配施下，燕麦田土壤环境及其微生物的生态差异，揭示不同剂量肥料的输入对燕麦田土壤生态功能的影响，优选出最佳施肥模式，为晋北地区燕麦的种植和提质增效提供参考意见。

1 材料和方法

1.1 试验地概况

试验于2022 年在山西农业大学高寒区作物研究所毛皂试验基地（N112°34′～114°34′，E39°03′～40°44′）进行。该地海拔1 050 m，属中温带干旱区，土壤有机质含量为12.61 g/kg，土壤全氮含量为0.81 g/kg，土壤有效磷含量为5.03 mg/kg，土壤pH值为8.37。

1.2 试验材料

选用燕麦品种晋燕17 号为试验材料，由山西农业大学高寒区作物研究所提供。试验所用肥料为尿素和自制有机肥，其中，尿素N 含量≥46%；自制有机肥以牛粪为主要原料，其有机质含量为15.8%，N 含量为0.046 g/kg。

1.3 试验设计

试验采用随机区组排列。播前进行精细耙耱镇压，平整后人工开沟条播，小区面积为10 m2（2 m×5 m），3 次重复，种植密度为400 万株/hm2，播种深度3～5 cm，行间距约25 cm。

试验共设7 个处理，以不施肥处理为对照（CK），分别设置仅施用氮肥（T1）和氮肥与有机肥分别按照9∶1（T2）、8∶2（T3）、7∶3（T4）、6∶4（T5）和5∶5（T6）的比例配施，共计21 个小区，其中，T1 处理N 的施用量为180 kg/hm2，T2～T6 等5 个处理N 的总用量与T1 处理一致，对应有机肥施用量按照配施比例计算，P、K 施用量各小区均相同，试验期间各处理田间管理保持一致，具体施用量如表1 所示。

表1 各处理的肥料施用时期和施用量Tab.1 The fertilizer application period and dosage of each treatment

1.4 测定项目及方法

1.4.1 土壤样品采集与测定 于燕麦成熟期，各小区按对角线5 点采集燕麦根际土壤，采用四分法取0.2 kg 土壤样品，3 次重复。取样后，一部分土样，风干后测定常规土壤化学指标[16]，包括全氮（TN）、速效氮（AN）、速效磷（AP）、速效钾（AK）、有机质（OM）；另一部分土样-80 ℃保存进行土壤微生物分析。

1.4.2 籽粒产量测定 于燕麦成熟期，收获测定各小区的种子产量。

1.4.3 土壤微生物总DNA 提取及生物信息学分析 使用MN NucleoSpin 96 Soil（Germany）试剂盒进行DNA 的提取，每个样品重复3 次，采用PacBio 测序平台的通用引物（正向27F 和反向1492R），以细菌16SrRNA 基因全长序列（V3-V4）为目的片段进行PCR 扩增，扩增体系参照艾锋等[17]，扩增合格的样品在北京百迈克生物有限公司进行测序分析，对得到的高质量CCS 序列进行生物信息学分析，具体方法参照艾锋等[17]文献。最后，使用PICRUSt 软件进行细菌功能类群预测[18]。此外，利用STAMP 和R 软件进行方差分析等。

1.5 数据分析

利用Microsoft Excel 2009 进行数据整理，采用SPSS 22.0软件用单因素方差分析不同处理间的差异显著性（P＜0.05），采用Pearson法进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 不同处理下土壤养分及籽粒产量的变化

不同处理下土壤特性和籽粒产量如表2 所示。

表2 不同处理下土壤特性和籽粒产量比较Tab.2 Comparison of soil characteristics and seed yield under different treatments

由表2 可知，与CK 相比，各处理的土壤全氮（TN）和速效氮（AN）含量均有所增加，但各处理间差异不显著；对土壤速效钾（AK）、速效磷（AP）和有机质（OM）含量则有显著影响，其中，速效钾（AK）和速效磷（AP）含量均在T3 处理时最高，分别为251.14、10.99 mg/kg，与其他处理间差异显著（除T4处理外，P＜0.05）；随着施入有机肥肥量的增加，土壤中有机质的含量逐渐增加，在T6 处理时达到最大，为14.86 g/kg，与其他各处理间差异显著（除T5、T4处理外，P＜0.05）。此外，籽粒产量T4 处理最大，为4 357.61 kg/hm2，与其他处理间差异显著（P＜0.05）。

2.2 土壤微生物特征的变化

2.2.1 土壤细菌群落多样性分析 本研究计算了减氮配施有机肥处理下燕麦根际土壤细菌群落的Alpha 多样性。丰富度指数评估（图1）发现，Chao1和ACE 指数具有相似的变化规律，表现为T6 处理高于其他处理；多样性评估表明，T3 处理Shannon多样性指数最高（8.78），与最低的T2 处理间差异显著（P＜0.05）；T1 处理的Simpson 指数最高，仍以T2 处理的最低，二者间差异显著（P＜0.05）。

图1 不同处理下土壤细菌群落Alpha 多样性Fig.1 Alpha diversity of soil bacterial communities under different treatments

采用主坐标分析（Principal co-ordinates analysis，PCoA）结果表明（图2），T5、T6 处理落在第1 象限，T4 处理落在第1 象限和第4 象限，T3 处理落在第1 象限和第2 象限，T1 和CK 落在第2 象限，而T2 处理则落在第3 象限，与其他处理间无交集产生，且T2 处理与其他6 个处理间存在显著差异（P＜0.05）。

图2 不同处理下土壤细菌群落的PCA 分析Fig.2 The PCA analysis of soil bacterial communities under different treatments

2.2.2 细菌群落组成 分析结果显示（图3-A），相对丰度占比较高的是变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi），它们占细菌群落相对丰度的76.6%以上。

图3 不同处理下细菌门（A）和属（B）的组成结构Fig.3 Composition and structure of bacterial phyla（A）and genus（B）under different treatments

图4 不同处理下环境因子和土壤细菌的相对丰度间的RDA 分析Fig.4 Redundancy analysis（RDA）of environmental factors and relative abundance of soil bacteria under different treatments

在这些占主要优势的门中，CK、T1、T2 这3 个处理中的优势菌为变形菌门，它的相对丰度占比最高，分别为44.21%、45.64%和43.93%，且CK、T1、T2 与T3、T4、T5、T6 处理间差异显著（P＜0.05）；随着有机肥施入量的增加，变形菌门的相对丰度占比出现下降，厚壁菌门成为优势菌，其中，以T4 处理中相对丰度占比最高，达到36.12%，与CK、T1和T2 处理间差异显著（P＜0.05）；拟杆菌门作为第三丰富的优势门，在T2 和T4 处理中相对丰度较高，分别为23.16%和20.64%，与其他5 个处理间差异显著（P＜0.05）；放线菌门在T3 处理中最为丰富（17.53%），但与CK（16.21%）间差异不显著；绿弯菌门则在T3 处理中相对占比最高（8.26%），与CK（7.88%）间差异不显著，与其他5 个处理间差异显著（P＜0.05）。

在属水平（图3-B）上，已分类的相对丰度较高的属（＞1%）有不可培养c-Subgroup-6（unculturedbacterium-c-Subgroup-6）、鞘脂单胞菌属（Sphingomonas）、不可培养bacterium（uncultured-bacterium）、乳酸菌属（Lactobacillus）、拟杆菌属（Bacteroides）等。其中，鞘脂单胞菌属（Sphingomonas）为第1 优势菌属，在CK 中相对丰度占比最丰富（5.42%）；乳酸菌属（Lactobacillus）和拟杆菌属（Bacteroides）两类菌属则主要分布在T4、T5、T6处理中，相对丰度显著优于其他4个处理（P＜0.05）；不可培养c-Subgroup-6（uncultured-bacterium-c-Subgroup-6）则在CK、T1 处理中相对丰度较高，占比均超过5.20%。

2.2.3 不同处理的细菌群落结构与其环境因子的关系 在属水平上，冗余分析（RDA）结果表明（图4），第1 种和第2 种RDA 成分能够累积解释细菌菌群30.11%的变化，且不同环境因子对属水平上细菌群落的影响有所差异，其中，AN 与Lamia、鞘脂单胞菌属（Sphingomonas）相对丰度呈显著正相关（P=0.004），而与WCHB1-32、假单胞菌属（Pseudomonas）呈显著负相关（P=0.003）；OM、AK、TN与红球菌属（Rhodococcus）、芽孢杆菌属（Bacillus）、巨单胞菌属（Megamonas）、乳酸菌属（Lactobacillus）相对丰度呈显著正相关（P=0.003），亦与WCHB1-32 呈显著负相关（P=0.004）。

2.3 土壤细菌PICRUSt 基因功能预测

为了解减氮配施有机肥处理下沙壤土细菌代谢功能，使用PICRUSt 软件比对测序数据获得的物种组成信息，进行功能基因预测（图5-A），经与KEGG 数据库比对发现，不同肥料处理下的土壤菌群基因序列，在一级功能代谢通路下注释到的功能主要分为新陈代谢（Metabolism）、环境信息处理（Environment information processing）、遗传信息处理（Genetic information processing）、细胞转化（Cellular processes）、人类疾病（Human diseases）和生物体系统（Organismal systems）等6 类，其余为PICRUSt 目前无法鉴定的细菌类群。与不施肥处理（CK）相比，细胞转化功能基因的丰度表现为T3、T4、T5、T6 处理有显著降低的趋势，而遗传信息处理和生物体系统功能基因的丰度表现为T4、T5、T6 处理有显著增加的趋势，但新陈代谢、环境信息处理和人类疾病功能基因的丰度在各处理间无显著差异。

图5 不同施肥处理下土壤细菌功能基因KEGG 丰度（一级功能层（A）和二级功能层（B））Fig.5 KEGG abundance of soil bacterial functional genes under different fertilization treatments（primary functional layer（A） and secondary functional layer（B））

在二级功能预测中（图5-B），不同肥料处理下的土壤菌群差异基因主要集中在10 个通路中，其中，全局和概览通路（Global and overiew maps，41.17%～43.51%）、碳水化合物代谢（Carbohydrate metabolism，8.26%～9.71%）、氨基酸代谢（Amino acid metabolism，6.27%～8.01%）、能量代谢（Energy metabolism，3.95%～5.88%）、辅助因子和维生素代谢（Metabolism of cofactors and vitamins，3.37%～5.09%）为主要子功能。与不施肥处理（CK）相比，各处理的氨基酸代谢和辅因子和维生素代谢功能基因显著增加（除TI、T2 外，P＜0.05），氨基酸代谢功能显著降低（除T2 外，P＜0.05），而其他功能基因未有显著差异。

3 结论与讨论

在燕麦生产中，施肥是向农田系统输入养分元素的最主要途径，也是人为调控、管理养分不可替代的技术手段。但传统的燕麦田施肥是以作物高产为唯一目标，年复一年投入大量的化学肥料，不但造成营养元素利用率较低，而且还引起土壤有机质含量减少、土壤污染等问题。因此，科学、合理的肥料配施（有机肥和无机肥）有助于燕麦田养分高效利用。本研究发现，随着施入有机肥肥量的增加，有机质含量明显增加，与刘佳遥等[18]、商丽荣等[19]、XU 等[20]的研究结果基本一致。此外，T4 处理下籽粒产量达到最大，这也说明在该处理下不但可以保证燕麦正常生长发育所需的氮素，而且对土壤生态最有利。

土壤生态系统中所有的微生物种类以及它们与环境之间相互作用的多样化程度被称为土壤微生物多样性[9]，包括了物种多样性、功能多样性、结构多样性及遗传多样性等不同层面[8]。其中，土壤生态系统中微生物的物种丰富度和均一度，是微生物多样性的最直接表现形式[21]。本研究表明，Chao1 和ACE 指数表现为T6 处理最高，与T4、T5处理间差异不显著。此外，肥料措施作为对土壤扰动的一种重要方式，也将会给微生物群落结构和成分带来显著的影响[4,17]。在本研究中，变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidota）、放线菌门（Actinobacteriota）、绿弯菌门（Chloroflexi）等5 个菌门最具优势，它们占细菌群落相对丰度的76.6%以上，这与前人的研究基本一致[22-24]。而且不同减氮配施比例引起的土壤环境因子变化对不同微生物群体的影响各不相同[17]。本试验RDA 分析结果表明，AN、OM、AK、TN 对处理中的细菌群落有着更为显著的影响作用，例如，OM、AK、TN 与红球菌属（Rhodococcus）、芽孢杆菌属（Bacillus）、巨单胞菌属（Megamonas）、乳酸菌属（Lactobacillus）相对丰度呈显著正相关。

PICRUSt 功能预测表明，燕麦田减氮配施有机肥后土壤细菌群落的主要功能是新陈代谢，表明代谢是细菌群落主要的核心功能，同时具有环境信息处理、遗传信息处理、细胞转化、人类疾病和生物体系统等5 个功能，其中，减氮增施有机肥提高了遗传信息处理和生物体系统功能基因丰度，这可能是由于有机肥添加显著富集了与碳循环相关功能基因，有助于提升有机质的转化及碳源的利用率，后续将结合宏基因组学测序进一步分析燕麦田减氮配施有机肥后土壤细菌的群落功能。

综上所述，减氮配施有机肥处理下，随着有机肥比例的增加，土壤中有机质的含量逐渐增加，在T6 处理时达到最大，籽粒产量在T4 处理下达到最大。与不施有机肥土壤相比，增施有机肥后显著提升了变形菌门、厚壁菌门的相对丰度。并且减氮配施有机肥后明显降低了土壤细菌细胞转化功能基因的丰度，明显增加了生物体系统功能基因的丰度。