急性缺氧诱导小鼠心肌细胞微小RNA-34a升高和凋亡实验研究

刘龙梅,石懿玉,杨 霞,介 希,连婷婷,王仲朝,韩学斌

(山西省心血管病医院/研究所 山西医科大学附属心血管病医院,山西 太原 030024)

急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)是临床常见的危急重症疾病,是由急性持续性冠状动脉缺血、缺氧造成部分心肌急性坏死引起的严重冠心病,其基本特征表现为起病急、进展快、预后差,目前已经成为引起我国居民死亡的最主要疾病之一[1]。尽早恢复急性心肌梗死患者正常血供可使心肌缺血减轻,但可能导致再灌注损伤,加快心肌细胞坏死,严重者可发生恶性心律失常甚至死亡,因此治疗急性心肌梗死时要重视心脏保护[2]。通过心肌修复,对抗心肌凋亡,对于AMI治疗有积极的意义。Li等[3]发现,miRNA-34a在心脏中高度表达,miRNA-34a通过对相关靶基因的表达调控,参与多种病理生理过程,与血管损伤和细胞凋亡均有密切的关系[4]。之前有研究表明[5-6],微小RNA-34a(microRNA-34a,miR-34a)参与AMI后心肌修复,RNA纳米技术在心肌修复靶向治疗中的应用报道较少。本实验选取含有antimiR-34a的纳米颗粒(Nanoparticles,NP)干预缺氧24 h后的原代小鼠心肌细胞,观察其在急性缺氧小鼠心肌细胞心肌修复中的作用与影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料 C57BL/6J小鼠购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司。胎牛血清购自美国Gibco公司。PNUTS、GAPDH抗体购自美国Abcam公司。antimiR-34a纳米颗粒购自美国Nanobio Delivery Pharmaceutical有限公司。miScript SYBR Green试剂盒购自德国QIAGEN公司。Western blot试剂、流式细胞测试试剂盒购自山西赛奥生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠乳鼠心肌细胞原代培养与鉴定:C57BL/6J雌雄小鼠自然繁殖,取2～4 d龄小鼠乳鼠,75%乙醇消毒,剪开胸部迅速取出心脏,预冷D-Hanks液中将心室剪成1 mm3碎片,加5 ml消化液,室温静置5 min后弃上清,再加5 ml消化液,室温静置20 min后,将未完全消化的心脏碎片吸到另一个无菌离心管中,加入2 ml预冷培养液终止消化,1000 r/min离心5 min后弃上清,沉淀中加入D-Hanks液3 ml,1500 r/min离心10 min后弃上清,沉淀物加培养液2 ml,用吸管吹打成悬液,吸到细胞培养瓶内,37 ℃、5%CO2孵箱培养[7]。将培养成熟的心肌细胞接种于玻底培养皿中,固定液12 min,PBS清洗,0.2%Triton X-100室温通透 5 min,PBS清洗。5%羊血清室温封闭2 h,加1∶100稀释好的rat anti-mouse α-actin antibody,封膜4 ℃过夜。第2天PBS清洗,加1∶200稀释好的goat anti-rat IgG二抗,37 ℃避光孵育1 h。弃去后加PBS清洗3次,每次10 min,加DAPI,封片,荧光显微镜下拍照、计数,计算纯度。

1.2.2 实验分组:采用随机数表将其分为三组:对照组(Control组,C组)、急性缺氧组(Ischemia组,I组)、急性缺氧+antimiR-34a纳米颗粒组(Ischemia+antimiR-34a NP组,I+NP组)。缺氧使用厌氧包与细胞一起孵育。于缺氧前60 min在培养液中加入antimiR-34a纳米颗粒。

1.2.3 实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)测miR-34a的表达:使用无RNA酶的枪头和离心管,Trizol法抽提总RNA,使用Nanodrop 2000检测RNA浓度及纯度,将终浓度定为100 ng/μl。反应体系为:miScriptHispct(5×)4 μl,miScriptNucleics(10×)2 μl,miScript Reverse Transcriptase 2 μl,RNA 模板12 μl。逆转录条件:37 ℃ 60 min,95 ℃ 10 min。最后加入80 μl ddH2O水稀释。按照试剂盒进行qPCR反应,反应体系10 μl:预加热95 ℃ 30 min,变性94 ℃ 15 s,退火55 ℃ 30 s,延伸70 ℃30 s,共40个循环。Ct值为反应孔的荧光信号达到设定阈值的循环数。采用U6作为内参,miR-34a相对表达量为2-ΔΔCt=CtmiR-34a-CtU6。miR-34a引物5’-TGACTGGCAGTGTCTTAGCT-3’,内参U6引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’,重复3次。

1.2.4 Western blot检测PNUTS蛋白的表达:使用RIPA提取液,加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂,4 ℃匀浆,取上清,BSA法定量,8% SDS-PAGE电泳后转膜,5%脱脂奶粉封闭1 h,加一抗anti-PNUTS抗体和内参anti-GAPDH抗体4 ℃摇床过夜,1×TBST洗膜3次后加入二抗,再次1×TBST洗膜3次后,ECL发光,凝胶成像系统曝光,Image J分析条带灰度值。

1.2.5 流式细胞术测凋亡:消化离心收集细胞至离心管中,PBS洗2遍,每管加入500 μl 1×Binding Buffer重悬细胞,每管加入5 μl Annexin V-FITC和10μl PI染料,混匀,室温避光孵育5 min,过膜,流式细胞仪检测。

1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0统计学软件进行分析。计量资料采用“均数±标准差”表示,两两比较采用独立样本t检验,组间比较采用单因素方差分析;P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 小鼠心肌细胞原代培养及其鉴定 通过细胞免疫荧光,加入α-actin一抗检测原代心肌细胞,镜下可见培养成熟的小鼠心肌细胞,纯度在95%以上。通过3次重复实验表明,缺氧组miR-34a表达增加,相比较差异有统计学意义(P<0.05)。加入了antimiR-34a纳米颗粒后,抑制了细胞内miR-34a的表达,差异有统计学意义。见图1。

图1 小鼠心肌细胞miR-34a表达(细胞免疫荧光染色,×200)

2.2 小鼠心肌细胞miR-34a扩增倍数 对照组(C组)的miR-34a扩增倍数是(1.02±0.04)。与C组相比,急性缺氧组(I组)的miR-34a扩增倍数为(2.07±0.18)明显增高,差异有统计学意义(P<0.05)。与I组相比,急性缺氧 + antimiR-34a纳米颗粒组(I+NP组)的miR-34a扩增倍数为(1.44±0.11) 明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

注:与C组比较,*P<0.05;与I组比较,#P<0.05

2.3 小鼠心肌细胞PNUTS蛋白表达 经过24 h急性缺氧处理后,miR-34a下游蛋白PNUTS的表达降低,加入antimiR-34a纳米颗粒后表达上升,比较差异有统计学意义(P<0.05),见图3。

注:与C组比较,*P<0.05;与I组比较,#P<0.05

2.4 小鼠心肌细胞凋亡率比较 对照组(C组)的凋亡率是(0.05±0.00)。与C组比较,急性缺氧组(I组)的凋亡率为(0.17±0.01)明显增高,差异有统计学意义(P<0.05)。与I组比较,急性缺氧+antimiR-34a纳米颗粒组(I+NP组)的凋亡率为(0.10±0.05) 明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

注:与C组相比,*P<0.05;与I组相比,#P<0.05

3 讨 论

急性心肌梗死已经成为全球发生率和病死率最高的一类疾病[8]。尽管近年来该病治疗方法和技术取得巨大进步,但缺血缺氧引起的心肌损伤仍然是造成患者死亡的重要原因。近来研究证实抑制miR-34a可以降低急性心肌梗死后所发生的细胞死亡和纤维化情况,促进心肌功能的恢复[9-10],过表达miR-34a可促进缺氧复氧和高血糖状态下心肌细胞株H9C2 凋亡[11-12],提示miR-34a在促心肌细胞凋亡中发挥重要调控作用。缺氧参与心肌细胞miR-34a的表达,以往研究多集中缺氧复氧后的研究,或者慢性长期缺氧方面,而关于早期缺氧的研究较少[5-6,13-16]。本研究通过观察急性缺氧对原代小鼠心肌细胞miR-34a表达的影响,发现急性缺氧miR-34a基因表达明显升高,其下游的蛋白磷酸酶1核靶向亚基(PNUTS)蛋白亦明显升高,同时激活了细胞凋亡;通过加入antimiR-34a纳米颗粒干预,可以有效进入心肌细胞,减轻急性缺氧引起miR-34a基因升高、PNUTS蛋白升高及细胞凋亡。

有研究发现,缺氧复氧导致大鼠H9C2心肌细胞miR-34a表达下调,通过miR-34a激动剂才可以增加其表达[13-14]。这与本实验的观察正好相反,可能与细胞来源不同、复氧抵抗miR-34a有关。通过文献我们反向推断得出,急性缺氧是可以导致miR-34a升高的。本实验通过培养原代小鼠心肌细胞做qRT-PCR测miR-34a证实了这样的推论。其中,与对照组miR-34a的表达倍数(1.02±0.04)比较,急性缺氧组(2.08±0.18)和急性缺氧+antimiR-34a纳米颗粒组(1.44±0.11)均升高(均P<0.05)。同时发现antimiR-34a纳米颗粒预干预并不能完全抵抗缺氧导致的miR-34a升高,且与急性缺氧组相比,急性缺氧+antimiR-34a纳米颗粒组的这种抵抗比较差异有统计学意义(P<0.05)。结果提示,急性缺氧上调miR-34a基因的表达,antimiR-34a纳米颗粒可以抵抗这种上调趋势。我们推断,这种含有antimiR-34a的纳米颗粒,或可以进入心肌细胞影响细胞内环境,从而发挥与之前的文献一致的效果[6]。

有研究人员找到了miR-34a的一种新型直接靶标PNUTS,能调低端粒缩短,DNA损伤反应和心肌细胞凋亡,并且促进急性心肌梗死后的功能恢复[15]。在通过干扰PNUTS的同时,miR-34a亦会受到影响[16]。本实验结果发现,与对照组的(1.12±0.05)比较,急性缺氧组的PNUTS /GAPDH灰度值比值为(0.31±0.03),提示PNUTS表达显著降低。加入antimiR-34a纳米颗粒后,PNUTS /GAPDH灰度值比值为(0.78±0.09),与急性缺氧组(0.31±0.03)比较差异有统计学意义(P<0.05)。PNUTS作为miR-34a的下游反馈基因呈负相关。antimiR-34a纳米颗粒下调急性缺氧诱导的PNUTS降低。再次证实急性缺氧的确与miR-34a这一靶标高度相关,miR-34a可能成为急性缺氧期PNUTS发挥心肌修复作用的生物标志靶点[15-16]。

心肌细胞坏死和凋亡是心肌损伤的细胞学基础[17]。细胞凋亡参与了冠心病、心肌病以及慢性心力衰竭等多种心血管疾病的病理生理进程,缺氧、机械应力、神经激素、炎症、氧化应激等多种刺激因素引起或加剧心肌细胞凋亡[18]。急性缺氧可以诱导凋亡已获得证实[19]。但是凋亡是否与miR-34a增高有关,是否与PNUTS增高有关,有待进一步研究。本实验通过在急性缺氧条件下加入antimiR-34a纳米颗粒后发现,antimiR-34a纳米颗粒下调急性缺氧诱导的凋亡。其中,与对照组的凋亡率(0.05±0.00)相比,急性缺氧组的凋亡率升高至(0.17±0.01),提示急性缺氧可以导致心肌细胞凋亡的发生。加入antimiR-34a纳米颗粒后,急性缺氧+antimiR-34a纳米颗粒组的凋亡率降为(0.10±0.05),与急性缺氧组相比有所降低(P<0.05),提示antimiR-34a纳米颗粒具有下调凋亡率的作用,抵抗急性缺氧后心肌凋亡的发生,保护心功能。同时,急性缺氧+antimiR-34a纳米颗粒组的凋亡率与对照组的比较差异有统计学意义(P<0.05),提示急性缺氧深度参与了细胞凋亡的发生,而antimiR-34a纳米颗粒不可完全逆转这种凋亡损伤。

靶向干预心肌细胞凋亡可能是心血管疾病的潜在治疗方式[20]。纳米颗粒靶向治疗的应用,是目前科研界新的探索。研究表明[6],antimiR-34a纳米颗粒在动物体内具有较好的亲和性。本次实验发现,antimiR-34a纳米颗粒或也有良好的心肌细胞靶向作用,能够呈递antimiR-34a进入心肌细胞,延缓心肌细胞凋亡,改善心功能。

综上所述,急性缺氧上调小鼠心肌细胞miR-34a表达,上调下游PNUTS蛋白的表达和心肌细胞凋亡的发生;antimiR-34a纳米颗粒可以进入心肌细胞抵抗急性缺氧引起上述损伤。但是,目前仍然需要更进一步的观察和机制研究来评价antimiR-34a纳米颗粒的安全性与有效性,为RNA纳米技术在AMI靶向修复中提供更多科学依据。