跨膜4域亚家族成员6D基因敲除致雄性小鼠生育力降低实验研究

刘俊璇,曾继涛,何 畏

(陆军军医大学第一附属医院生殖医学中心,重庆 400038)

不孕症的医学定义为未避孕未孕超过1年,对8%～12%的夫妇造成了困扰[1],根据世卫组织的统计,全世界有超过5000万对夫妇患不孕不育症,其中50%与男性因素有关[2-3]。男性不育的主要原因之一是精子发生异常,临床上称为少精症或无精症[4]。精子质量问题导致男性生育力下降的现状逐渐引起临床医生的关注,尽管对雄性生殖的研究取得了很大进展,但我们对于少、弱精症的机制缺乏了解,在很大的程度上阻碍了对男性不育症的治疗。

研究表明,免疫因素在精子发生过程中发挥着重要的作用,其中睾丸巨噬细胞作为睾丸内数量最多的免疫细胞,在保护精子发生免受自身免疫攻击过程中扮演着重要的角色,可维持睾丸的免疫豁免,其功能障碍将导致睾丸内睾酮水平降低、不育和性欲减退,被誉为生育的守护者[5-7]。细胞发挥功能需要多种表面分子协同工作,以传递适当的信号,相应环境刺激。Ms4a家族是一组具有四个跨膜结构域的结构相关蛋白质,通过调节信号传导,在调节细胞活化、生长和发育中发挥重要作用[8-10]。跨膜4域亚家族成员6D(Membrane-spanning4-domainssub family a member 6D,Ms4a6d)是该家族中的一员,主要表达在巨噬细胞表面和树突状细胞等表面[11]。研究显示Ms4a6d参与免疫受体的生物学功能的调节,Ms4a6d可与巨噬细胞表达共刺激因子VSIG4(V-setandIgdomain-containing4)结合形成表面抑制信号复合物,通过介导JAK2-STAT3-A20信号通路的激活,从而抑制NLRP3炎性体的产生,可有效抑制巨噬细胞的炎症状态[12-13]。考虑到巨噬细胞炎症状态对精子生成的重要影响,我们推测Ms4a6d同样在精子发生过程中扮演重要的角色。我们研究Ms4a6d基因敲除小鼠模型,通过生育力比较、睾丸形态学分析和精子质量分析,探究Ms4a6d基因缺失对雄性小鼠生育力的影响,以期为男性不育症患者的诊疗提供新的思路和方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物:Ms4a6d基因敲除小鼠通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建,由陆军军医大学免疫教研室陈永文教授惠赠。对照组小鼠为C57BL/6野生型(Wild-type,WT),购自陆军军医大学动物实验中心(符合国家级动物标准)。小鼠饲养条件保持一致,温度为22～26 ℃,相对湿度50%～60%,光照周期14 L∶10 D,定期更换干净饮用水、饲料及垫料,保持饲养环境的安静、卫生。实验中涉及到的动物操作已得到陆军军医大学实验动物福利伦理审查委员会批准。

1.1.2 试剂仪器:动物睾丸组织固定液(Servicebio,货号:G1121),F12培养基(Thermo,货号:31765035),Krebs-Ringer缓冲液(Solarbio,货号:G0430),一抗MCSFR(Servicebio,货号:GB111205),荧光二抗CY3山羊抗兔(Servicebio,货号:GB21303),PCR试剂盒(重庆绎恒生物技术有限公司),HE染色试剂(上海碧云天生物技术有限公司),PCR仪及电泳仪(美国Bio-Rad公司),台式低温离心机(美国Thermo公司),M8光学显微镜(北京万邦君意商贸有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠基因型鉴定:取小鼠耳部组织5 mm,剪碎后加入裂解液,56 ℃水浴过夜,采用DNA提取试剂盒提取基因组DNA,以提取DNA为模板,鉴定野生型基因所用引物(引物F:5’-CATGTCCAGACTGTAAGCGCCACT-3,引物R:5’-TGTATTGGCCTG-ACTAAAGCAGAAATCA-3’),鉴定敲除基因所用引物(引物F:5’CATGTCCAGACTGTAAGCGCCACT,引物R:5’-TGTGGAGAAGCACCTGAATGCAGA-3’),冰上配置25 μl反应体系(DNA提取液1 μl,引物F 1 μl,引物R 1 μl,2×Taq PCR Mix12.5 μl,ddH2O补至25 μl),PCR扩增条件:(94 ℃ 3 min→94 ℃ 30 s→55 ℃ 30 s)×30个循环→72 ℃ 1 min→72 ℃ 5 min,经PCR仪扩增后取部分反应产物以1%琼脂糖凝胶电泳后拍照分析,鉴定小鼠的基因型。其中引物设计原理:选取Ms4a6d的外显子2和3作为作用靶点(图1A),在靶点两侧分别设计引物F和引物R用于扩增野生型基因(长度3678 bp),进一步在作用靶点外侧和两作用靶点之间设计引物F和引物Wt/He-R用于扩增敲除基因(长度602 bp)(图1A)。

A:基因敲除及引物设计策略示意图;B:鉴定野生型和阳性纯杂合子;C:鉴定阳性纯合子与杂合子

1.2.2 睾丸巨噬细胞免疫荧光染色:取出动物睾丸组织固定液固定的睾丸组织样本;依次经梯度脱水,透明,浸蜡,包埋制成石蜡块;石蜡切片脱蜡至水,组织切片置于盛满EDTA(pH8.0)抗原修复液的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。采用BSA封闭30 min,一抗4 ℃孵育过夜(一抗稀释比,MCSFR 1∶200),PBS漂洗3次,每次5 min,二抗室温孵育1 h(二抗稀释比,CY3山羊抗兔1∶300),PBS漂洗3次,每次5 min,DAPI复染细胞核10 min,加入自发荧光猝灭剂,封片后显微镜下观察并采集图像。每组随机选取5个视野,使用Image J对图像进行平均荧光强度分析。

1.2.3 小鼠生育力检测:取经过鉴定的8～10周龄Ms4a6d-/-雄鼠10只,以1∶2的比例与育龄期WT雌鼠合笼,每天清晨和下午各检查一次雌鼠的阴道栓形成情况,见到阴道栓后即视为交配完成,取出雌鼠单独饲养直至分娩。如未观察到阴道栓则继续合笼,直至交配成功后取出雌鼠单独饲养,统计雌鼠怀孕率和产仔数。同法选取健康野生型雄鼠作为对照。

1.2.4 小鼠睾丸指数测定与组织病理学分析:小鼠睾丸指数测定:取8～10周龄的Ms4a6d-/-雄鼠和WT雄鼠各5只,处死小鼠后电子天平称量小鼠体重并记录。迅速用眼科剪剪开腹部,解剖取得小鼠双侧睾丸,吸水纸上吸干后采用电子天平称重,将Ms4a6d-/-雄鼠及WT雄鼠睾丸置于同一直尺下对比形态大小,拍照保存。将一侧睾丸置入睾丸组织固定液固定48 h,继续后续实验,另一侧睾丸经液氮冷冻后放于-80 ℃保存备用。小鼠睾丸器官指数计算公式如下:睾丸器官指数(%)=睾丸质量(g)/体重(g)×100%。

石蜡切片经脱蜡、复水、染色、脱水、封片等环节,完成HE染色切片,显微镜下观察并拍照。采用View Point BETA软件测量曲细精管管腔直径及管腔厚度,分别计数生精小管中的支持细胞、精原细胞、初级精母细胞和精子细胞。

1.2.5 小鼠精子参数检测:取8～10周龄经鉴定的Ms4a6d-/-雄鼠和WT雄鼠各5只,处死小鼠并消毒腹部后用眼科剪分离双侧附睾尾,分离除去多余脂肪组织后,放入经37 ℃预热的Krebs-Ringer Buffer中,用1 ml注射器针头小心划开附睾,37 ℃热台上放置5 min待精子充分从附睾尾中释放,充分吸取上清液置于1.5 ml EP管中,37 ℃水浴保存。使用计算机辅助精子分析系统进行小鼠精子参数检测,每次检测至少达到5个视野和200条以上的精子。分析精子数量、活率及精子运动情况:包括前向运动精子数(PR)、平均曲线运动速率(VCL)、平均直线运动速度(VSL)、平均路径速度(VAP)、运动的前向性(STR)、精子平均鞭打频率(BCF)、精子平均头部侧摆幅值(ALH)等。

2 结 果

2.1 Ms4a6d-/-雄鼠基因型鉴定 以雄性小鼠DNA为模板,配制反应体系,经PCR扩增后采用1%琼脂糖凝胶电泳曝光,引物设计原理图1A。鉴定小鼠基因型电泳结果:泳道7无680 bp条带,为野生型(图1B),其中泳道1、2、3、4、5、6泳道中DNA条带在680 bp附近,可能为阳性纯合子或杂合子,泳道5、6的DNA条带在602 bp附近,表示杂合子,泳道1、2、3、4无602 bp条带,表示纯合子(图1C)。

2.2 Ms4a6d-/-成年雄鼠睾丸巨噬细胞的检测 免疫荧光染色结果显示,与WT雄鼠相比,Ms4a6d-/-雄鼠睾丸间质区域及曲细精管MCSFR平均荧光强度显著降低,差异具有统计学意义(均P<0.05)。见图2。

A:MCSFR免疫荧光染色结果;B:MCSFR平均荧光强度统计结果(n=5)。注:与WT组比较,*P<0.05

2.3 Ms4a6d-/-雄鼠的生育力检测 Ms4a6d-/-雄鼠对应雌鼠受孕率为65%,低于WT雄鼠对应雌鼠的90%,两组比较差异无统计学意义(P>0.05),Ms4a6d-/-雄鼠与WT雄鼠对应的雌鼠平均产仔数分别为(2.5±2.1)只、(7.1±3.1)只,Ms4a6d-/-雄鼠子代数目显著低于WT小鼠,差异具有统计学意义(均P<0.05)。见表1。

2.4 Ms4a6d-/-成年雄鼠睾丸发育及组织病理学改变 将Ms4a6d-/-雄鼠和WT雄鼠处死后解剖取出完整的睾丸,清理周围附睾组织后置于直尺旁拍照观察,结果显示Ms4a6d-/-雄鼠睾丸相较于WT雄鼠睾丸体积显著减少(图3A),对两组小鼠进行称重,计算睾丸器官指数,发现Ms4a6d-/-雄鼠体重(20.12±0.99)g,与WT雄鼠体重(19.15±0.37)g无明显统计学差异(P>0.05)(图3B),Ms4a6d-/-雄鼠睾丸质量(0.06±0.01)g,明显低于WT鼠睾丸质量(0.08±0.01)g(P<0.05)(图3C),而Ms4a6d-/-雄鼠的睾丸器官指数(0.29±0.05)%明显低于WT雄鼠(0.42±0.04)%(P<0.05)(图3D)。石蜡切片HE染色结果显示与WT组小鼠相比,Ms4a6d-/-小鼠睾丸组织中生精小管内精原细胞、精母细胞和精子细胞明显减少,仅见少量支持细胞,生精小管直径缩小,生精细胞缺失,部分生精上皮空泡化(图3E、3F),见表2。

表2 小鼠睾丸生精小管上皮及单个生精小管横截面上各种细胞数量比较

2.5 Ms4a6d-/-雄鼠精子参数检测 取Ms4a6d-/-雄鼠和WT小鼠,获取附睾尾精子,利用计算机辅助精子分析技术(CASA)分析精子参数,显微镜下见Ms4a6d-/-雄鼠精子数量明显少于WT雄鼠;分析数据显示,Ms4a6d-/-雄鼠的精子浓度为(2.30±2.49)×106/ml,WT组为(14.91±3.95)×106/ml,Ms4a6d-/-雄鼠精子浓度相较于WT雄鼠显著降低(P<0.05),精子运动参数比较无统计学差异(P>0.05)。见表3。

表3 各组精子参数比较

3 讨 论

Ms4a家族作为一类新发现的参与细胞信号传导的膜蛋白,在与不同免疫受体相互作用和调节信号通路中发挥着重要作用。尽管该家族功能如此重要,但目前对于该家族的研究主要集中在Ms4a1、Ms4a2和Ms4a4A等成员,仍有许多Ms4a蛋白的功能特点不为人知,特别是Ms4a6d,很少有关于该成员的文献报道[14-15]。本实验室在对Ms4a6d-/-雄性小鼠的饲养过程中,发现该动物模型小鼠出现生育能力下降等现象,众所周知,巨噬细胞在雄性精子发生中发挥着重要作用,而Ms4a6d基因主要在巨噬细胞表面表达,因此我们推测Ms4a6d基因可能通过巨噬细胞参与小鼠生殖的调控。我们希望进一步验证Ms4a6d基因在雄性生殖中的作用,以期发现该基因的功能,为男性不育症的诊疗提供新的思路。

本研究中的Ms4a6d-/-雄鼠通过CRISPR/Cas9技术构建而成,该技术根据目的基因序列,设计向导RNA,在其介导下即可实现定向基因打靶。具有简单快捷,靶向效率高,不需要胚胎干细胞,可以在绝大多数生物中应用等优点,是近年来研究基因特点的常用技术[16-17]。本实验所用Ms4a6d-/-实验小鼠均通过敲除小鼠繁育而来,剪取新生代小鼠耳部组织提取DNA,经PCR扩增后行琼脂糖凝胶电泳进行基因型鉴定,经基因型鉴定的小鼠纳入后续实验中。

在本次研究中我们将Ms4a6d-/-雄鼠与野生型雄鼠分别与育龄期雌鼠合笼交配,结果显示Ms4a6d-/-雄鼠对应的雌鼠产仔数明显低于WT组,表明Ms4a6d-/-雄鼠的生育能力下降。免疫荧光染色结果表明Ms4a6d基因敲除导致雄鼠睾丸巨噬细胞数量明显减少。接着我们对比发现Ms4a6d-/-雄鼠睾丸体积小于WT鼠,同时睾丸器官指数减小,为探索小鼠精子数量的改变是否与其中的细胞组成变化具有相关性,我们将WT与Ms4a6d-/-雄鼠睾丸进行石蜡组织切片及HE染色,结果显示Ms4a6d-/-雄鼠睾丸生精小管直径及管腔厚度均明显减少,支持细胞,精原细胞,初级精母细胞和精子细胞均减少。睾丸是精子发生的主要场所,睾丸的体积及组织结构与生精能力具有一定的相关性[18],因此我们合理的猜测Ms4a6d-/-雄鼠的精子发生或成熟可能受到一定的影响。基于上述研究结果和假设,我们对小鼠附睾尾精子进行了检测,结果显示Ms4a6d-/-雄鼠附睾尾的精子浓度显著降低,精子运动能力无明显差异。上述结果表明Ms4a6d的缺失导致雄性小鼠生精功能受损。研究表明精子的发生需要免疫抑制微环境,睾丸炎症状态可导致精子发生障碍,精子数量减少。由于血睾屏障的存在,睾丸被认为是免疫特权器官,对炎症反应具有抵抗力,实际上睾丸可受自身免疫性炎症的影响,处于免疫和抑制免疫之间的微妙平衡[19]。研究表明Ms4a6d与VSIG4相互作用形成表面信号复合体,从而抑制炎症因子Nlrp3和白细胞介素-1β(IL-1β)的生成。推测Ms4a6d基因的敲除会导致炎症因子表达增多,影响睾丸免疫抑制状态,引起精子生成受损,进而对生育能力造成影响[13]。

精子发生始于精原干细胞,通过减数分裂和一系列形变成为精子,这一过程受到复杂的调控。巨噬细胞是睾丸内数量最多的免疫细胞,主要分布在睾丸间质及曲细精管周围,睾丸巨噬细胞被认为通过对精原干细胞的影响干预精子的生成[20]。研究显示巨噬细胞可产生部分集落刺激因子(CSF1),而CSF1被认为可单独或与其他调节因子一起共同促进精原干细胞的增殖和自我更新缺乏CSF1的小鼠表现为不育及精子减少[21]。此外,巨噬细胞表达ALDH1A2和RDH10,两者都是维甲酸(RA)合成所需要的关键生物酶,而RA被认为可促进精原细胞分化并启动减数分裂,在生精过程中发挥重要功能,通过耗竭RA可导致精子分化发生在初始阶段,巨噬细胞可通过CSF1和RA干预精子的生成[22-24]。本次研究通过免疫荧光染色发现Ms4a6d-/-雄鼠的睾丸间质巨噬细胞和管周巨噬细胞数量受到影响,这可能是导致雄鼠生育能力下降,精子生成减少的原因。具体的影响机制需要后续实验进一步研究论证。

我国男性不育症的发病率呈现逐年上升的趋势,其中精子质量是导致男性不育的关键因素[25-27]。精子发生受到多种基因表达的调控,与精子发生直接相关的基因出现表达异常可能会引起男性不育[28-29],目前仍有大量的男性不育症患者病因未知,给临床诊疗带来了很大的困扰。本次研究发现Ms4a6d基因敲除告知雄性小鼠生育力下降,Ms4a6d通过何种途径干预巨噬细胞功能,进而调控精子发生影响生育力,有待进一步探究。