热休克蛋白70促进脊髓损伤恢复研究进展

周立新,孙忠人,尹洪娜

(1.黑龙江中医药大学,黑龙江 哈尔滨150040;2.黑龙江中医药大学附属第二医院,黑龙江 哈尔滨150006)

脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)是脊髓和马尾神经细胞急性创伤性损伤,进而引发组织离断、出血,产生不可逆病理性改变,脊髓功能丧失的一种疾病[1]。损伤可分为原发性和继发性。原发性是外力压迫脊髓实质导致实质变形,影响正常的血液供应,并表现为出血、水肿或缺血[2];继发性损伤是在原发性损伤基础上所引起的炎症反应、神经元凋亡、脂质过氧化、兴奋性毒性神经递质积累、组织水肿等[3]。急性或亚急性期的继发性损伤是SCI的治疗重点。

热休克蛋白(Hsps)是机体在发生缺血、高温、氧化应激、重金属和药物等刺激时应激反馈而形成的蛋白质[4]。在生物体内广泛存在,主要参与受损神经元修复并清除受损蛋白质,同时介导细胞炎症反应、凋亡、氧化应激等生理病理过程。其中,热休克蛋白70(Hsp70)由于其高度保守性,经常被作为反应应激现象的检测指标。最近发现,Hsp70对继发性SCI的损伤修复起着至关重要的作用,故本文总结Hsp70促进脊髓损伤恢复的研究进展,以期为进一步提高SCI研究水平提供借鉴。

1 Hsp70概述

热休克蛋白是所有物种中表达最高的细胞蛋白之一,它们占非应激细胞总蛋白质的1%～2%。然而,当细胞被加热或受到其他应激源时,Hsps的比例增加到所有细胞蛋白质的4%～6%[5]。从整体来看,它们的分子量范围在10～150 kDa。Hsps按照分子量的大小可分为Hsp100、Hsp90、Hsp70、Hsp60、Hsp40以及小分子Hsps。其中,Hsp70是热休克蛋白家族中研究广泛的Hsps。

Hsp70有N端核苷酸结构域(NBD)和C端底物结合结构域(SBD)两个结构域。44 kD N端NBD具有腺苷三磷酸酶活性,并与Hsp70辅酶DnaJ结合。这些结构域由一个保守的连接NBD和SBD的连接子连接,最近表明这对结构域间的通信至关重要[6]。当ATP与NBD结合时,α-螺旋盖会被打开,此时SBD与底物的亲和力较弱,从而导致底物的释放。而当ATP水解成ADP或NBD未结合核苷酸时,α-螺旋盖会关闭,这样底物就被锁在底物结合袋中。此时,SBD与底物的亲和力较强。因此,Hsp70功能的发挥需要ATP调控底物的结合和释放,同时还需要一些辅助因子的协同和调控来实现[7]。第一类辅助因子是由Hsp40等辅助分子组成的伴侣,它们可以与Hsp70的NBD结合,刺激其ATP酶活性,从而加速ATP的水解[8]。同时,这些辅助因子还能够将底物转移至Hsp70分子中。第二类辅助因子则是一类核苷酸交换因子,它们能够促进ADP和ATP的交换,从而加快Hsp70与底物结合和释放的周期[9]。第三类辅因子是与Hsp70的C端相互作用的蛋白,它将Hsp70结合的底物运送到溶酶体和蛋白酶体进行降解[10]。

在细胞内,Hsp70主要分布于内质网、细胞核、线粒体和细胞质中。其中,内质网和线粒体分布着两个Hsp70家族成员:Hsp70-5(BIP/GRP78)和Hsp70-9(MTHSP70/GRP75),余下的Hsp70家族成员则分布于细胞核和细胞质中[11]。根据表达情况,Hsp70在哺乳动物中主要有两种表现形式。一种是通常存在于正常细胞中的结构型热休克蛋白70(HSC70),表达量只在受到应激刺激后才略有上升;另一种是受应激刺激后作为保护性分子显著升高,但平时仅在正常细胞中少量表达的诱导型Hsp70,是对应激最敏感的一类Hsps。

2 脊髓损伤后Hsp70表达的调节机制

热休克转录因子(Heat shock transcription factors,HSFs)介导了Hsp70的表达,主要通过特异性结合热休克元件序列来调控Hsps的基因表达[12]。其中HSF1是必要的调控因子,在生理状态下它与Hsps相结合,而在应激状态下,它与Hsps分离并游离出来,游离的HSF1被蛋白激酶C磷酸化转移至细胞核,进而形成活化的三聚体,促进更多的Hsps的产生[13]。相关研究表明,在继发性脊髓损伤阶段,神经元和胶质细胞的细胞膜骨架受损,线粒体结构被破坏,神经酰胺和活性氧大量产生,而HSFs被激活并发挥着促进Hsps产生的关键作用,从而保护受损神经元[14]。

Hsps的表达是一个自我调节过程。正常条件下,Hsp70少量存在于细胞中,并与HSFs结合抑制HSFs活性。该条件下的HSFs与Hsp70基因的HSE区域的结合水平很低[15]。在应激反应发生时,胞内变异蛋白、新生蛋白等蛋白大量增加,与Hsp70高亲合力结合,游离的HSFs数量增多活性增加。HSFs与HSE通过磷酸化和聚合反应高水平快速大量结合生成HSF/HSE复合体,促进Hsp70基因的高效转录,直至Hsp70的水平足够结合HSF使其活性降低,进而关闭热休克基因的表达。

3 Hsp70治疗脊髓损伤的作用机制

在脊髓损伤发生后,蛋白质的错误折叠和聚集会积累神经毒素,进而引发炎症反应和细胞凋亡。Song等[16]使用DNA微阵列技术证明Hsp70是SCI后最常产生并且最先表达的蛋白质之一。Hsp70使脊髓损伤后错误折叠或非正常聚集的蛋白正常折叠或降解,维持蛋白质稳定,并且在抗炎、抗细胞凋亡和抗氧化应激等生理和病理过程中起着重要的调节作用。

3.1 分子伴侣作用 大多数蛋白质在折叠、运输和装配过程中都需要其他蛋白质的参与。在折叠新的肽链形成蛋白质的三级结构的过程中,这种特殊的蛋白质起着稳定蛋白质构象的作用。但本身不发生任何变化,也不参与蛋白质的形成。这类能够促进新肽链的折叠、多聚体合成、识别并防止错误折叠蛋白产生的蛋白质称为分子伴侣[17]。

Hsp70是目前发现的主要伴侣蛋白之一,是一种非特异性的细胞保护蛋白。在各种应激条件下,Hsp70在细胞内的线粒体和内质网等各种细胞器之间通过伴随蛋白分子进行转运。主要作用是使蛋白质多肽链在胞浆中稳定;加速折叠失调蛋白的再折叠;与核糖体上新生多肽结合参与合成新的蛋白而取代那些破坏严重不可修复的蛋白;同时通过阻碍变性蛋白疏水区的聚集,增强其溶解性等方式促进变性蛋白的恢复或加速其降解和清除,从而提高细胞对应激的耐受性,维持细胞的正常生理功能等[18]。SCI后可继发蛋白质聚集物的错叠和累加。Wang等[19]的研究结果证实,通过提高Tau蛋白液-液分离液滴的流动性,Hsp70可以有效地抑制错误折叠蛋白的积累。

3.2 抑制炎症反应 脊髓损伤后,星形胶质细胞、小胶质细胞和T细胞激活并浸润损伤部位引起大量炎性因子(IL-8、TNF-α、IL-1β、IL-6等)释放,导致组织损伤和神经变性,血脊髓屏障被破坏,神经元和少突胶质细胞凋亡以及胶质瘢痕的形成,最终致使神经功能受损[20-21]。因此,抑制炎性反应可以减轻SCI的继发性损伤,防止机体功能的进一步损害。

根据Chamney等[22]的研究,在小鼠脊髓损伤后,Hsp70的上调可以有效地减少肌肉中白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达水平。Xu等[23]通过SCI的体内和体外模型发现,Hsp70主要通过抑制核转录因子κB(NF-κB)信号通路的活化来减少SCI后炎症因子的表达。生理条件下,NF-κB与NF-κB抑制(IκB)蛋白以无活性的方式结合存在于细胞质中,当机体受到应激刺激时,IκB 活激酶复合物(IKK)被激活,发生磷酸化和泛素化,NF-κB与IκB解离进入细胞核,与靶基因中NF-κB 的结合位点相结合,启动靶基因转录,下游炎性因子表达增加[24]。因此已有研究[25]推测,Hsp70抑制NF-κB活化可能的机制为:①Hsp70通过结合IκB激酶(IKK)的亚单位IKKγ,抑制其活性,阻碍IκB降解,进而影响NF-κBp65入核;②热休克反应可使胞浆中游离IκB的数量增多,从而干扰激活的NF-κB向胞核移位;③Hsp70与NF-κB竞争核膜孔通道,阻碍NF-κB向胞核转移,最终阻碍其功能发挥。Wang等[26]研究发现,低频脉冲电磁场可以通过上调Hsp70的表达,减少炎症和氧化应激,促进SCI后功能恢复。因此,通过抑制炎症因子的表达,SCI后活化的Hsp70能够减缓脊髓组织的进一步损伤。

3.3 抑制凋亡反应 神经细胞凋亡是引起脊髓继发性损害的一种重要病理机制。在SCI后,轴突的受损导致神经细胞无法得到营养供应,进而触发神经细胞凋亡。这种凋亡会阻断神经传导通路,从而导致继发性的SCI。因此,抑制神经细胞的凋亡对于促进SCI的恢复是非常有益的。

作为Hsps家族的重要成员,Hsp70在细胞中的表达可以抵抗应激诱导的细胞凋亡,并通过参与不同的凋亡信号转导途径直接影响细胞凋亡。Hsp70参与的经典的凋亡途径主要有两种:一种是由半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-9(Caspase-9)启动的内源性凋亡,依赖于线粒体释放因子。另一种是死亡受体介导的外源性凋亡,由半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8(Caspase-8)的激活触发。最终,两种凋亡途径均由半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)完成。其中依赖于线粒体释放因子的内源性细胞凋亡是导致SCI后持续细胞丢失的关键因素。

B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)蛋白通常位于线粒体外膜上,其作用是阻止Bcl-2相关的X蛋白(Bax)形成的孔道,从而调节线粒体介导的细胞凋亡[27-28]。当SCI发生时,线粒体介导的细胞凋亡常常被触发,导致Bcl-2表达量降低,细胞色素C逸出线粒体进入细胞质基质中,与凋亡蛋白酶激活因子1(Apaf-1)结合,从而激活了Caspase-9,触发了Caspase级联反应,最终导致细胞凋亡的发生。此外,外源性凋亡是细胞外损伤因子(如1L-1β、TNF-α等)与细胞膜表面受体结合,募集到细胞内与死亡结构域蛋白FADD形成复合物。最后,FADD通过死亡效应结构域的二聚体与前体Caspase-8结合。形成死亡诱导信号复合体(DISC),Caspase-8被激活,Caspase-8继而激活Caspase-3,导致细胞凋亡[29]。

SCI后,合成增加的Hsp70通过不同途径和机制阻止细胞发生凋亡,使机体从各种应激反应中得到恢复。Nasouti等[30]发现,海藻糖的作用机制是通过增加热休克蛋白27和热休克蛋白70的表达来发挥其保护作用。这可以防止细胞色素c从线粒体中释放,并减少Caspase-3的表达,最终保护脊髓免受进一步的损伤。Hsp70抑制细胞凋亡可能有两种途径:首先,在线粒体外,Hsp70与Apaf1结合,募集到凋亡小体。该过程主要有两种机制阻碍功能性凋亡小体的组装来抑制凋亡,第一种是通过直接结合Apaf-1和抑制低聚。第二种是通过保持低聚物,使Apaf-1 CARD结构域不暴露,从而使低聚物的构象与前体半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(Procaspase-9)募集不相容。其次,Hsp70还可以通过与TNF相关的凋亡诱导受体1/2(TRAIL-R1/2)结合来阻止凋亡。纯化的Hsp70体外实验[31]表明,Hsp70能抑制细胞色素c/DATP介导的Caspase激活,但不抑制Apaf-1的寡聚。Hsp70通过与Apaf-1直接结合来抑制功能性凋亡小体的形成,细胞凋亡过程被抑制。除此之外,在神经缺血模型中,Hsp70通过提高Bcl-2水平来抑制细胞凋亡[32]。与Hsp70作用的另一种凋亡调节蛋白是Bid蛋白,它被Caspase-8激活,将Bax蛋白(Bcl-xl protein)转移到线粒体膜,促进线粒体释放各种死亡因子,Hsp70通过抑制Bid蛋白的激活来阻断细胞凋亡过程。Gabai等[33]证实,在肿瘤坏死因子诱导的细胞凋亡中,突变型Hsp70和野生型Hsp70均能抑制Caspase-8和Bcl-2家族成员促凋亡蛋白Bid的激活,产生抗凋亡作用。

3.4 抗氧化应激 氧化应激是氧自由基及其代谢产物过度累积的一种病理状态,它破坏人体的抗氧化防御系统。活性氧(ROS)是引起氧化应激的重要因素,包括羟基自由基、过氧化氢和超氧阴离子等。SCI发生后,损伤区域处于缺血缺氧状态,线粒体中钙离子急剧上升,产生的自由基会超过过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)和超氧化物歧化酶(SOD)等内源性抗氧化剂的中和能力。

相关研究[24]表明,Hsp70可以促进抗氧化剂CAT、GSH和SOD的表达。Hsp70的表达上调可以增加CAT和SOD的产生,进而降低诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和ROS的水平。Xu等[34]在胶质细胞的研究中证明,谷胱甘肽的产生增加可以促进HSP70的过表达进而使细胞免受葡萄糖剥夺和H2O2的损伤。朱兴等[35]进一步表明,在缺血再灌注大鼠模型中,Hsp70合成的增加与GSH的增加具有一致性。因此,推测Hsp70对自由基清除剂的产生和活性具有促进增强作用,可以清除大量自由基,缓解脂质过氧化。SOD在平衡机体氧化和抗氧化方面发挥着至关重要的作用,能明显缓解脊髓损伤,是细胞内天然的氧自由基清除剂。现有研究[36]认为,一方面,Hsp70可促进体内SOD的产生,抑制NADPH氧化酶(Nox),使ROS的生成以反馈的方式降低。另一方面,通过直接释放和提高内源性SOD水平,缓解机体的氧化应激。因此,脊髓损伤后,增加Hsp70的表达可以有助于提高脊髓神经元对氧化应激的抵抗能力。这是通过促进抗氧化剂蛋白的产生来实现的,从而减少氧化应激的损害,并有助于保护神经元的结构和功能不受进一步的损伤。

4 小结与展望

综上所述,Hsp70与脊髓损伤后神经功能的恢复密切相关。而且在发挥功能时需要相对应的辅助分子伴侣Hsp40,核苷酸交换因子以及与Hsp70的C端相互作用的蛋白帮助,以便发挥其多样性功能。同时其表达也是需HSFs介导的自我调节过程。脊髓损伤后,作为保护分子的Hsp70表达增加,并发挥分子伴侣,抑制炎症反应,抑制凋亡反应,抗氧化应激等保护作用,缓解脊髓继发性损伤,提供以Hsp70为基础的脊髓损伤治疗新思路。尽管Hsp70能够加速折叠失调蛋白的再折叠,促进变性蛋白的恢复或加速其降解和清除,但Hsp70通过什么途径决定底物去向目前尚不清楚。目前,脊髓损伤领域的研究热点之一是如何诱导SCI后Hsp70的表达,促进神经功能的恢复。近年来,通过药物、低频脉冲等方法诱导Hsp70表达的研究虽有一定进展,但尚无临床应用报道。此外,迄今为止的许多研究都集中在Hsp70单独作用上,但这种蛋白的全部治疗效果可能取决于它与其他分子联合应用以更好地发挥神经保护作用。因此,探索Hsp70形成和作用的深层机制,研发对Hsp70诱导效率高、经济成本低且不良反应小的药物,探究将Hsp70与其它分子共同应用,将是今后一个重要的研究方向。