易栓症分子遗传学研究进展

杨旭虎,徐 伍,刘建成,杨海霞,马 鑫,李玉洁,范 进,裴海峰

(1.西部战区总医院神经内科,四川 成都 610083;2.南方医科大学第五附属医院泌尿外科,广东 广州510900;3.西部战区总医院康复科,四川 成都 610083;4.西部战区总医院儿科,四川 成都 610083;5.西部战区总医院心内科,四川 成都 610083)

易栓症的发生与凝血系统、抗凝系统及纤溶系统密切相关,当多种遗传或获得性因素使得三者稳态失衡,导致机体出现容易发生血栓栓塞的疾病或状态,即易栓症。易栓症最早是在报道家族性抗凝血酶缺陷时提出[1],突出表现为静脉血栓栓塞(Venous thromboembolism,VTE),常见为下肢深静脉血栓(Deep venous thrombosis,DVT)形成。DVT患者肺梗死的发生率约为30%,严重威胁人类生命健康。有研究表明,外源性损伤如脾脏破裂程度越严重,对凝血功能的影响越严重[2];部分凝血相关因子联合心肌标志物,还可应用于冠心病的诊断[3]。而随着对易栓症研究的不断深入,发现遗传性因素在其发生中起着重要作用。通过分析国内外有关易栓症的分子遗传学研究,总结遗传性易栓症相关基因特征的研究进展,以期为进一步的研究提供思路。

1 易栓症发病的人群特征

遗传性易栓症是一种常染色体显性遗传病,群体发病率约为7%,该病的患者VTE发生的风险是普通人群的3～20倍[4]。根据凝血系统和抗凝、纤溶系统不同的生理功能及各自基因突变产生的影响,可将易栓症的分子遗传学因素归为两大类:凝血相关因子和抗凝相关因子的基因突变或多态性。其发病特点,有着明显的种族和地域差异:亚洲人群VTE的患病率为8%～30%,而高加索人群为1%～2%。其中,凝血因子Ⅴ Leiden G1691A 突变(FVL)和凝血因子Ⅱ (FⅡ) G20210A 突变主要见于西方人群,亚洲人群最常见的是抗凝血酶(AT)、蛋白C (PC)、蛋白S (PS)等基因突变[5]。

2 与凝血过程相关的基因及人群分布特点

人体凝血途径分为内源性和外源性,均是在凝血相关因子参与下,完成的凝血过程,凝血相关因子的异常改变将会对凝血过程产生重大影响。从分子遗传学角度,常见的凝血因子基因突变有FⅤ G1691A突变、FⅡ G20210A 突变等,凝血因子Ⅰ(FⅠ) 、VⅢ(FVⅢ)基因突变也有相关报道。此外,亚甲基四氢叶酸还原酶 (MTHFR)的基因多态性,也会对凝血过程产生影响。凝血因子Ⅲ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅻ及血管紧张素转换酶(ACE)基因突变,与血栓形成的关系尚未见有显著意义的研究成果或观点尚未形成统一[6]。

2.1 凝血因子

2.1.1 凝血因子Ⅴ:FV是由肝脏产生的一种糖蛋白,为体内凝血酶原最主要的激活物,其编码基因位于1号染色体长臂2区3带(1q23)位点。变异后的FV即FVL,在1 q23染色体上第1691位点DNA核苷酸发生G→A突变,引起氨基酸序列出现 Arg506- Glu改变,抗活化蛋白C (APC)的裂解。这导致凝血酶原片段F1+D-二聚体(D-D)以及其他活化的凝血标志物水平升高,表现为轻度血栓形成前状态,发生VTE的风险增加了2～5倍,是易栓症的主要遗传危险因素之一[7]。此外,在创伤、手术、妊娠和激素替代治疗的患者中,FVL可能延长住院时间、增大复发可能。FVL突变占遗传性易栓症病例的40%～50%,在不同国家和地区的人群中其发生率差异较大,在欧美地区的发生率高于亚洲、非洲和澳大利亚地区,但FVL突变与地区的相关性也不是绝对的[8]。

2.1.2 凝血因子Ⅱ:FⅡ,即凝血酶原,在凝血过程中被激活形成凝血酶,导致血小板的活化。FⅡG20210A 突变,是指11pl1-11q12 20210位发生G→A突变,凝血酶原水平增加,引起VTE风险增加约3倍。而同时存在FⅤ G1691A和FⅡ G20210A突变的携带者,VTE风险增加约16倍。FⅡG20210A 突变在南欧常见(3%),北欧次之(1.7%),希族塞人的患病率(7.8%)比欧洲人高2.2倍,而在亚洲和非洲人群中非常罕见[9]。

2.1.3 凝血因子Ⅰ (FⅠ)、Ⅷ (FⅧ):FⅠ(即纤维蛋白原)分子量为340 kD,是由三条对称分布的肽链(Aα,Bβ,γ)组成的糖蛋白二聚体,其由三个纤维蛋白原基因(FGA、FGB和FGG)编码,均位于4q23-4q32。Salomon等[10]研究表明,在FGA 基因中 c.259A>C 突变与易栓症密切相关。FⅧ分子量为300 kD,基因定位于Xq28,外显子数26。血浆中FⅧ由两条肽链组成,重链由A1-A2-B或A1-A2结构域组成,分子量为90～200 kD不等; 轻链由A3-C1-C2所组成,分子量为80 kD,二条肽链间由Ca2+连接;有研究发现FⅧ与妊娠早期绒毛膜下血肿(SCH)相关[11]。凝血因子FⅢ、FⅦ、FⅨ、FⅩ、FⅫ等与血栓形成的关系目前尚未见有意义的研究成果。

2.2 其他凝血相关因子 亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)可使高半胱氨酸水平升高,增加VTE风险。其基因位于1p36.3位置,全长20374 kb,共有11个外显子,mRNA全长7,150 bp,编码656个氨基酸残基组成的蛋白,外显子5和6具有最多的突变[12]。MTHFR催化5,10-亚甲基四氢叶酸还原为5-甲基四氢叶酸,将甲基供体转化为甲硫氨酸的高半胱氨酸。MTHFR基因主要由C677T和A1298C两个多态性变异组成。C677T多态性位于第4外显子,密码子222处的丙氨酸转化为缬氨酸,该区域是MTHFR辅助因子黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的碱基结合位点。A1298C多态性位于第7外显子,谷氨酸在密码子429处转化为丙氨酸。MTHFR基因多态性会引起其构象变化,改变酶的活性[13]。在欧洲,MTHFR C677T等位基因的患病率很高,西西里岛和意大利发病率高达47.3%和45%,非洲和非裔美国人中C677T等位基因的发生率(3%)明显较低[14]。ACE基因突变是指ACE基因内含子16的287碱基对片段的插入(I)或缺失(D)组成的多态性。导致三种基因型:D/D和I/I纯合子和I/D杂合子。ACE是肾素-血管紧张素系统的关键酶,血管紧张素Ⅱ对纤溶系统的影响通过增加纤溶酶原激活剂1的水平而实现。

3 抗凝相关因子基因及人群分布特点

人体抗凝系统和纤溶系统分别起到抑制凝血过程和清除已形成血栓的作用。抗凝系统中,抗凝血酶Ⅲ(AT-3)、肝素、蛋白C(PC)和组织因子途径抑制物等物质抑制血凝过程。纤溶系统中,纤溶酶可清除纤维蛋白凝块和血管内的血栓,保证血液在血管内的畅通。在抗凝系统中,PS、PC、AT占比分别为7.3%、3.2%、0.5%,三者是目前研究最多的抗凝因子,亦是中国人群最主要的遗传性易栓危险因素[15]。其中,AT-3与PC基因的突变频率相当,PS基因突变较少[16]。此外,血栓调节蛋白(TM) THBD基因突变和狼疮抗凝物(LA) APOH基因突变也有所报道。

3.1 蛋白S(PS)相关基因 PS是一种重要的抗凝血剂,也是APC的非酶辅助因子。PS缺乏被定义为低血浆PS水平,其改变与VTE的可变风险相关。目前已知的PS基因在人类基因组中共有2个,均定位于 3q11.1-3q11.2:一个是 PSα 或 PR0S1,具有活性,基因长度约为80 kb,包含15个外显子和14个内含子;另一个是 PSβ 或 PROS2,无活性[17]。 PS主要在肝脏中合成,也可见于血管内皮细胞和血小板α颗粒,是一种维生素K依赖性的抗凝血蛋白,分子量为71 kD,由多个蛋白质结构域组成[18]。PS作为APC的一个非酶性的辅因子结合在磷脂表面,能加速APC灭活FⅤ、FⅧ,亦能使凝血酶和FX的活性有所减弱,使APC的抗凝活性增强。PS常以两种形式存在于血浆中:游离型占40%,具有APC辅因子的活性;无活性的结合型与经典补体途径中的补体4 结合蛋白以 1∶1 的比例形成复合物,约占60%。在我国,约50%VTE患者PS活性降低,但中国人群PS缺乏症的遗传学背景具有明显的异质性,不存在引起易栓症的优势变异[4]。

3.2 蛋白C(PC)相关基因 PC是一种在肝脏中合成的维生素K依赖性抗凝蛋白。凝血酶和血栓调节蛋白的复合物将PC激活为活化PC (APC),APC对内皮表面发挥重要的抗凝作用。APC及其辅因子PS通过灭活FⅤa和FⅧa抑制凝血酶的生成。健康人PC缺乏症的发病率约为0.2%～0.5%,VTE风险增加,凝血控制能力受损。PC的基因位于染色体2q13-2q14上,包括9个外显子和8个内含子,常见为C6152T突变(位于第7外显子),其中错义和无义变异最为常见。较为严重的杂合子PC缺乏,可导致新生儿暴发性紫癜或弥散性血管内凝血(DIC)等危及生命的疾病。杂合子PC缺乏可分为两种类型,Ⅰ型是PC的定量缺陷,抗原水平低和活性降低,占比75%～80%;Ⅱ型是一种定性缺陷,抗原水平正常,但PC活性降低[19]。

遗传性PC缺乏是公认的VTE危险因素,欧洲人群中PC缺乏症的患病率约为0.3%。与非携带者相比,杂合子的静脉血栓形成风险增加约7倍。无症状PC缺乏症发病率为0.2%～0.5%,而有临床意义的PC缺乏病发病率约为0.005%[20]。

PC缺乏症和PS缺乏症是亚洲VTE患者主要的遗传性危险因素,发病率分别为8.9%～10.7%和10.7%～17.8%,80%～90%的患者发生DVT或肺栓塞(PE)。中国VTE患者中,PC基因缺陷可能比AT基因缺陷更为普遍。

3.3 抗凝血酶(AT)相关基因 AT是一种天然抗凝血剂,通过共价结合凝血酶的活性丝氨酸和活化因子X使凝血酶失活。AT具有肝素结合位点在结合肝素后,其抗凝活性明显增强。遗传性AT缺乏症是一种罕见的与VTE相关的疾病,表现为常染色体显性遗传,其患病率介于0.2%～0.02%之间。

编码AT-3的SERPINC1基因位于1q25.1,共包含7个外显子区域。该基因对于微小的遗传缺陷敏感性高,任何错义突变都可能导致其编码的AT-3缺陷。临床上根据对编码的蛋白质结构/功能影响的不同,分为两型。Ⅰ型:经典型缺乏,患者合成AT-3障碍,血浆AT-3抗原和活性均显著降低超过50%;Ⅱ型:主要影响与凝血酶或肝素结合的结构域功能,但血浆AT-3抗原含量正常、活性减弱。其中,错义突变及框内缺失和插入所引起的基因改变常引起Ⅱ型AT-3缺陷,且编码功能异常蛋白的含量正常。最近报道了一种新的杂合错义突变 c.1385G>A (Cys462Tyr),导致279Cys-462Cys二硫键断裂,引发Ⅰ型遗传性AT缺陷[21]。

SERPINC1突变在日本患者中已有报道,且发现了一个新的杂合突变(单核苷酸T插入7916和7917处,Glu 272终止于第4外显子)。在中国VTE患者中,遗传变异c.881G>T (p.Arg294Leu)和c.883G>A (p.Val295Met)占主导地位[22]。

3.4 血栓调节蛋白(TM)相关基因 TM 基因THBD由1728个碱基编码的575个氨基酸残基构成,包括1个疏水的信号肽序列,1个凝集素区域,6个表皮生长因子 (EGF)区,1个低度保守连有硫酸软骨素链的丝氨酸苏氮酸富集区,1个跨膜区和1个胞质尾区,无内含子存在。EGF4-6结合凝血酶并活化PC,EGF 5-6片段也可与凝血酶结合,但复合物无法激活PC。凝血酶通过氢键与EGF4结合,同时通过疏水键与EGF5结合,EGF4和EGF5之间通过一个短环相连,Met388位于此短环之中。Met388的突变或氧化导致EGF4和EGF5四级结构发生变化,导致TM无法与凝血酶或PC正常结合,造成凝血异常[23]。

研究证实THBD c.1418C>T多态性与下肢DVT有关,主要发生在亚洲人群,THBD c.-151G>T变异引起基因的表达水平下降,在中国人群易栓症中也较为常见[24]。

3.5 狼疮抗凝物(LA)相关基因 LA在体内主要通过抑制生理性抗凝物质PC的激活和干扰外周血血栓烷A2和前列环素的变化,促进血栓形成。测序发现LA的APOH基因中可编码β2-糖蛋白I的四个多态性c.-32C>A、c.422T>C、c.461G>A 和 c.1004G>C,它们处于高度连锁不平衡状态,可能导致三种单倍型,即野生型H1、杂合型H2、纯合型H3。 H2和H3导致VTE 风险分别增加了大约1.5倍和7倍[25]。

APOH基因单倍型是LA产生的遗传易感因素,在中国人群中相关功能测试表明,其突变型 β2-糖蛋白I延长凝血酶凝固时间和增加凝血酶生成潜力的能力显著降低[25]。

3.6 其 他 组织因子途径抑制物(TFPI)基因突变,有研究认为其P1511 L、C-399 T、T287-C、C536 T等基因突变可导致VTE的发生,但也有研究表明C-399 T多态性的出现可能与VTE的发生没有明显的相关性,甚至T-287C和T-33C等位基因突变可能与降低血栓形成风险有关。

4 易栓症的筛查与基因诊断

易栓症的筛查常常用到血栓形成试验,但会受到许多生物学和分析变量的影响,如:急性炎症状态或抗凝期间、暂时性危险因素(手术、创伤或长期静止等),在上述特殊情况下发生VTE的患者不进行血栓形成试验,以避免因假阳性误诊,而使患者接受长期抗凝治疗,增加出血风险和医疗费用。大多数VTE管理指南也建议将易栓筛查限制在特定的临床场景中,以避免试验结果的偏差对抗凝治疗决定产生重大影响。因此,迫切需要新的易栓症筛查方法,基因诊断能避免生物学和分析变量的影响,在易栓症的诊断中有着广泛的应用前景。在临床工作中,可以根据具体场景,分别或先后给予易栓症的常规筛查和基因诊断。

4.1 易栓症的常规筛查 通常可以通过凝血筛选试验、特殊因子检测进行易栓症的常规筛查。凝血筛选试验主要包括活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间和凝血酶时间。对于急性VTE,低、中危险度血栓可能性患者可联合D-D检测,结果阴性可排除,阳性则可通过影像学检查来进一步明确。但D-D检测的诊断特异度在陈旧性血栓患者和老年人中较差(14%),不具有排除 VTE 的价值。特殊因子检测主要包括抗凝蛋白检测、抗磷脂综合征相关检测以及其他检测如血浆同型半胱氨酸,凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ和纤溶蛋白等。常见有血栓形成试验包括PC、PS和AT缺乏的定性分析;FVL和PT G20210A的基因分型;APLA检测(血清抗心磷脂和抗β2糖蛋白I抗体检测和狼疮抗凝剂检测)。

4.2 易栓症的基因诊断 VTE 易感基因存在于5%～10%的普通人群和至少 40%的 VTE 患者中,但并非所有易栓症患者都需要进行基因诊断。例如,在静脉血栓栓塞的急性期,PC/PS/AT水平可能较低,建议此时不检查PC/PS/AT水平,除非出现如暴发性紫癜的新生儿这类特殊情况。另有研究提出,只有当难以达到治疗性抗Xa水平时,才应检查AT水平,此外,在做MTHFR基因分析前,首先应筛选患者的同型半胱氨酸水平。因此,易栓症的基因诊断主要针对需要采取预防措施的VTE 患者或者是在 VTE 发生后需要特定或者长期治疗的患者。下面是基因诊断流程:①确定候选者:首先,所有首次自发性 VTE发作的患者都不是遗传性易栓症筛查的候选者。②基因诊断方法:用外周血血细胞、体液等生物样本,采用测序、对重点候选基因进行定量PCR、Sanger等方法进行检测,并对患者的直系亲属进行相同基因突变位点验证。

此外,Delate等使用国际疾病分类第9版(ICD-9),在易栓症基因的敏感性、特异性、阳性预测值(PPV)和阴性预测值,以及95%CI方面,产生最高的 PPV(41.5%,95%CI:26.3%～57.9%)和高特异性(95.9%,95%CI:94.0%～97.4%),为易栓症的基因诊断,提供了更好的理论依据。

5 展 望

由于凝血过程的瀑布效应,任何一个凝血相关因子的变化都会使凝血过程发生几何级的改变,未来可通过基因治疗药物对易栓症基因进行干扰、修复等,将对抑制血栓性疾病的发生具有重要的意义,但目前需要加强易栓症基因的筛查、诊断和靶向干预。

易栓症基因的筛查目前通常是在没有明确检测指征的患者和结果可能不可靠的时候进行,未来的研究需要找到更好的评估方式,以减少不利影响。加强对不同种族和地域人群易栓症遗传易感性的调查研究,可以使患者血栓形成的风险预测更加准确。易栓症的基因诊断为明确血栓病因提供了科学依据,但如何精准高效地开展值得我们深思。随着二代测序技术的日趋成熟,可对易栓症相关基因进行突变检测,使数据更加准确;CNV plex高通量多重基因拷贝数检测技术,使数据更加全面;建立易栓症基因检测Panel,使数据的获取更加快速准确。但由于易栓症基因涉及凝血、抗凝血、纤溶、抗纤溶等多个系统,建立同时涵盖这些基因的高通量测序技术,并使其能够全面和精准地诊断遗传性易栓症,将是未来易栓症基因诊断的发展趋势。