玉溪雪茄烟发酵霉变病原菌鉴定及生防菌筛选

付克剑，宋学茹，杨 芳，张立猛，崔永和，黄智华，苏友波*

（1.云南农业大学资源与环境学院，昆明 650201；2.云南省烟草公司玉溪市公司，云南 玉溪 653100）

雪茄烟（Cigar）是一种特殊烟草制品，雪茄烟叶经过采摘、调制后进行发酵，通过催化因子作用，原烟叶中的基础物质经一系列生物化学变化，使烟叶内的化学成分更加协调。然而雪茄烟在发酵过程中易受到霉菌侵染造成经济损失[1]。近年来，雪茄烟叶发酵霉变正成为我国南方部分烟区发酵环节烟叶品质下降的重要原因之一[2]。

有研究表明，雪茄烟叶在不同地区的储藏期和发酵期均存在霉变现象，曲霉属和青霉属真菌是导致烟叶霉变的主要致霉菌[3-4]。其中，曲霉属真菌包括黄曲霉（A.flavus）、黑曲霉（A.niger）、烟曲霉（A.fumigatus）、黄柄曲霉（A.flavipes）、米曲霉（A.oryzae）和聚多曲霉（A.sydowii），并有学者发现被曲霉属真菌侵染会呈现出生态毒理学特征。青霉属包括局青霉（P.restrictum）、扩展青霉（P.expansum）和产黄青霉（P.chrysogenum）[5-7]。这些霉菌的侵染不仅影响雪茄烟品质，还在一定程度上威胁着消费者的健康。

雪茄烟发酵霉变病的防治方法主要包括发酵工艺优化、化学防治。发酵工艺优化是基于现有发酵房的改造、发酵剂的喷施方法改良以及发酵堆的堆放方式进行的改进，该方法对致霉菌的防治最为方便、快捷，但成本高收效低[8-10]。化学防治则主要体现在发酵剂中的化学成分，化学药剂防效虽然较好，但易导致药剂残留、烟叶品质安全下降等问题，因此其应用至今未受到推广。生物防治因具有专一性强、环境友好以及不易引起病原菌产生抗药性等优点，受到研究者青睐。然而生物防治在该病防控中的应用较少。目前，已有研究者利用微生物进行雪茄烟的发酵，但大多数添加微生物的目的为降解大分子物质，进而提高其香气物质[11-13]，而以拮抗发酵过程中的致霉菌为目的的研究尚未见报道。近年来云南省玉溪市雪茄烟在发酵过程中出现大量暗绿色霉层滋生现象，严重时整叶呈暗黑状，影响烟叶品质，其霉变病原菌尚未得到系统鉴定，该病的高效绿色防控措施仍有提升空间。本研究通过病原分离、柯赫氏法则和致病性测定，明确玉溪雪茄烟叶霉变病的病原，筛选具有防治潜力的拮抗菌，并进行发酵试验评价拮抗菌的防霉变能力，以期为霉变防控提供生防材料。

1 材料与方法

1.1 霉变调查与样品采集

2022 年3—4 月在玉溪市调查雪茄烟发酵过程中烟叶霉变的发生情况，采集发霉烟叶样品；用无菌滤纸擦拭发酵房顶部、内部侧壁，采集发酵房内环境样品，将样品带回实验室用于病原菌分离培养。

1.2 培养基

病原真菌：PDA 培养基；生防细菌：NB 培养基或LB 培养基。

1.3 病原菌分离与保存

用无菌刀片切取发霉叶面病健交界处组织若干块，于75%乙醇中表面消毒5 s，无菌水中漂洗，用无菌纸吸干后置于PDA 培养基28 ℃暗培养，48 h后检测病原菌分离情况。对于环境样品的病原菌，直接将采集滤纸放置在PDA 培养基上进行培养。待长出菌落挑选边缘菌丝再培养，重复2～3 次，确认疑似病原菌后进行保存。

1.4 病原菌鉴定

1.4.1 柯赫氏法则鉴定 用PDA培养基于28 ℃暗培养霉变烟叶病健交界处分离得到的病原菌48 h，挑取少许菌丝置于光学显微镜观察。将病原菌接种在PDA 培养基上，28 ℃下生长5 d，用无菌超纯水收集孢子，通过三层无菌纱布过滤残留菌丝，用0.1%的葡萄糖溶液稀释孢子浓度至105spores/mL作为孢子悬浮液。将孢子悬浮液喷洒到健康雪茄烟叶，置于35 ℃、75%相对湿度条件下发酵，定期观察霉变发生情况，显症后再次分离病原菌，并与原分离物进行形态、显微、病状对比。

1.4.2 病原真菌的ITS 基因测定 参照前人研究[14]进行病原菌基因组DNA 的提取，扩增的PCR 产物在上海荣序生物技术有限公司进行测序，ITS 基因PCR 扩增的前向引物为 ITS1 （ 序列：CCGTAGGTGAACCTGCGG），反向引物为ITS4（序列：TCCTCCGCTTATTGATATGC），扩增长度500 bp 左右。将序列结果输入NCBI 网站（http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov）的生物技术信息中心数据库，使用BLASTn算法将样品序列与真菌模式菌株和参考菌株ITS 数据库进行比对，查找与近缘模式菌相关的序列。利用MEGA11 软件采用邻接法构建系统发育树。

1.5 生防菌筛选与鉴定

采用稀释涂布平板法[15]，将健康的雪茄烟叶样品用研钵捣碎，将1 g 捣碎烟样添加到试管中，加无菌水至试管10 mL 刻度处，盖塞振荡30 min。取其上清液1 mL 梯度稀释至104、105倍液，将100 μL稀释液加到NA 培养基上进行均匀涂布，并在28 ℃恒温养箱培育3 d。采集不同形态菌落的菌株，在NA 培养基上进行纯化。以病原菌为指示菌，采用平板对峙法筛选拮抗菌，将直径0.5 cm 的病原菌接至PDA 平板中心，并将纯化的生防菌接种到距离烟草疫霉2.5 cm 处的外围，呈等边三角形顶点或者正方形顶点形式点接，并以只接病原菌的PDA 平板为空白对照。在28 ℃恒温培养箱培育，直至对照平板的菌丝到达平板边缘。观察病原菌生长情况及周围是否产生抑制带，并测量抑制带宽度（mm）。选择抑菌效果较好的拮抗菌进行后续防治试验。使用通用引物27F-1492R 通过PCR 扩增生防菌的16S rDNA 基因，扩增的前向引物为 27F（序列：TACGGYTACCTTGTTACGACTT），反向引物为1492R（序列：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG），扩增长度为1.5 kb 左右，扩增的PCR 产物在上海荣序生物技术有限公司进行测序。参照1.4.2 中的方法进行序列比对并构建系统发育树。参照《微生物学实验》对菌株CD-1 的生理生化特性进行测定，并以实验室中的蜡样芽孢杆菌标准菌株作为对照组。

1.6 防霉变效果测定

选取大小均匀、无机械损伤和感染的雪茄烟叶进行发酵。将病原菌XJ-a 接种在PDA 培养基上，如1.4.1 中方法制备病原菌孢子悬浮液，将生防菌接种至150 mL 的NB 培养液中，28 ℃下，180 r/min摇动48 h，作为生防菌的种子液，将种子液离心并取离心所得的细胞颗粒溶于150 mL 的0.1%葡萄糖溶液作为生防菌发酵液备用。在发酵前同一时间点按先后顺序，先喷洒50 mL 病原菌孢子悬浮液后紧接着喷洒50 mL 生防菌发酵液作为处理组，先喷洒50 mL 病原菌孢子悬浮液后紧接着喷洒50 mL 无菌水作为对照组，每组发酵烟叶质量均为2 kg，置于35 ℃、75%相对湿度条件下发酵30 d。分别在发酵15 d 和30 d 进行采样并测定霉变率，试验重复3 次。

1.7 雪茄烟香气成分测定

将处理组与对照组发酵完成后的烟叶进行香气成分测定。将烟叶置于40 ℃下干燥4 h，研磨后过60 目筛，称量20 g 磨好样品，放入三角瓶，加入350 mL 蒸馏水和1 mL 20 μg/mL 内标溶液（正十七烷）。向50 mL 三角瓶中加入50 mL 乙醚置于60 ℃水浴下加热萃取。将得到的乙醚萃取液浓缩并定容至1 mL 后进行分析。采用GC-MS（Agilent 7890A, Agilent, USA）分别对发酵第15 天和第30天的烟叶进行香气成分测定，并参照文献[16]将致香成分分成叶绿素降解产物、类胡萝卜素降解产物、美拉德反应产物、西柏烷类降解产物。

1.8 统计分析

所有试验数据均采用SPSS Statistics 26 统计软件进行方差分析（ANOVA），并进行差异显著性检验（p<0.05），采用Excel 2016 对试验数据进行处理以及图表制作。每个处理包括3 个重复，试验重复2 次。

2 结 果

2.1 病原菌分离与鉴定

2.1.1 病原菌分离 经调查发现，在玉溪市发酵的雪茄烟包括云雪1 号、云雪2 号、多米尼加雪茄烟及普洱6 号，在发酵过程中均有霉变的现象，叶柄上有绿色霉菌，基部上会伴有少量白色菌丝着生，叶面上呈不规则状粘附着大量绿色霉层。经病组织分离，获得11 株菌落形态相同的真菌，从发酵房顶部、内部侧壁的样品中也可分离到相同的真菌。真菌在PDA 培养基上于28 ℃暗培养3 d 菌落直径可达7.5 cm。菌落呈半绒毛状，菌丝发达，菌丝初为白色，后为黄色（图1a）。分生孢子为球形或近球形，直径3.5～4.5 μm，着生在分生孢子梗上（图1b）。孢子囊呈棕黑色圆形或卵圆形，外表微观的凹凸纹理，直径10.5～13 μm（图1c）。其形态特征与黄曲霉菌相似。

图1 柯赫氏法则试验对比结果Fig. 1 Comparative results of Koch’s law test

2.1.2 柯赫氏法则鉴定结果 在发酵的第6 天开始显症，出现少量绿色菌丝依附在烟叶上，在发酵的第12 天，症状明显，病原菌侵染严重，出现大量绿色霉层。经再次分离的病原菌XJ-b 与原分离病原菌XJ-a 进行形态比较发现两菌在PDA 培养基上形态近乎相同，均呈黄色（图1a）；经显微镜下真菌形态对比，两菌菌丝宽度相近，孢子均为圆形和近圆形，直径3～4.5 μm，孢子囊均为圆形或卵圆形的结构，直径在10.5～13 μm 之间，高度相似（图1b、c、d）；经病状对比，原分离病原菌XJ-a 的来源样品与柯赫氏法则试验显症烟样的症状相似，均有绿色霉层依附，呈不规则斑状分布在烟叶上（图1e）。由此判断病原菌XJ-b 与原分离病原菌XJ-a 为同一致病菌。

2.1.3 分子鉴定 将菌株XJ-a 和XJ-b 的ITS 序列在NCBI 上进行BLAST 比对，下载相似度较高的参考序列后使用MEGA11 软件进行序列的多重比对，并构建系统发育树（图2）。菌株XJ-a 和XJ-b与GenBank 数据库中的Aspergillusflavus聚在一起，且 ITS 基因序列均与模式菌株A.flavusstrain Beca_79T 相似性最高，分别为99.73%、99.89%，与曲霉属（Aspergillussp.）的其他真菌相似性低于90%。基于ITS 的系统发育分析表明菌株XJ-a、XJ-b与多株A.flavus菌聚为一支，综合形态学和分子生物学特征，确定雪茄烟叶发酵霉变病原菌XJ-a 和XJ-b 为黄曲霉（A.flavus）。

图2 基于ITS 基因序列构建系统发育树Fig. 2 Construction of phylogenetic tree based on ITS gene sequences

2.2 生防菌筛选

本次从雪茄烟叶中共筛选出121 株烟草内生细菌，以病原菌XJ-a 为指示菌，从121 株烟草内生细菌中筛选获得14 株拮抗菌，其中CC-3、DM-3、OD-a 等3 株菌的抑菌带宽度均大于5 mm，从多米尼加雪茄烟叶中分离的生防细菌CC-3 表现出最强和最稳定的拮抗活性，其抑菌带宽度达9.04 mm，显著高于其他生防菌（图3），因此后续研究选用菌株CC-3 进行进一步试验。

图3 生防菌的拮抗作用Fig. 3 Antagonistic activities of biocontrol bacteria

2.3 菌株CC-3 的鉴定

菌株生理生化性质和16S rDNA 基因是鉴定菌株的重要指标。如表1 所示，菌株CC-3 革兰氏染色、淀粉水解试验、明胶液化试验、葡萄糖发酵试验、过氧化氢酶试验、甲基红试验及V-P 试验等测定结果为阳性；菌株D-甘露醇试验、柠檬酸分解试验、硫化氢试验、吲哚试验及乳糖发酵试验等测定结果为阴性，根据其测定结果初步判断菌株CC-3为芽孢杆菌属（Bacillussp.）。将菌株CC-3 的基因序列在NCBI 上进行BLAST 比对，下载相似度较高的参考序列后使用MEGA11 软件进行序列的多重比对，并构建系统发育树（图4），菌株CC-3 与GenBank 数据库中的Bacilluscereus聚类在一起，且16S rDNA 基因序列与蜡样芽孢杆菌（B.cereus）的同源度达100%。因此，将菌株CC-3 鉴定为芽孢杆菌属中的蜡样芽孢杆菌。

表1 菌株CC-3 生理生化试验结果Table 1 Physiological and biochemical characteristics of bacterium CC-3

图4 基于邻接法构建菌株CC-3 系统发育树Fig. 4 Construction of phylogenetic tree of isolate CC-3 based on neighbor-joining method

2.4 菌株CC-3 防治效果及香气成分分析

如图5 所示，对照组中发酵第15 天黄曲霉XJ-a已明显侵染烟叶，呈绿色霉层依附在烟叶上，在发酵的第30 天侵染霉层略有变少且颜色略有变淡，而添加了生防菌CC-3 的处理组中，两个发酵时期均无大块霉层附着，只有微小霉层粘附至烟叶边缘上，难以用肉眼观察到。经防治效果分析（图6），仅用黄曲霉XJ-a 处理的烟叶，在发酵的15 d 和30 d，霉变率分别达69.35%、55.39%，而XJ-a 处理的基础上再用生防菌CC-3 发酵，两个时期的霉变率分别下降64.44%和52.66%，仅为4.91%和2.73%。说明雪茄烟发酵过程中，生防菌CC-3 可以有效抑制黄曲霉的侵染。

图5 添加菌株CC-3 发酵烟叶霉变情况Fig. 5 Mildew of tobacco leaves fermented by adding strain CC-3

图6 菌株CC-3 防治效果Fig. 6 Control effects of strain CC-3

两个发酵组的致香成分总含量均随发酵时间的增长而增加（图7），在发酵完成后处理组香气物质总量较对照组提高28.96%，对照组在发酵15 d和30 d 的致香成分总含量分别为2.12 和3.00 mol/L，两个时期均显著低于处理组，并且对照组的烟叶香气成分的增加主要集中在叶绿素降解产物，而处理组的烟叶类胡萝卜素降解产物、美拉德反应产物、西柏烷类降解产物均有显著增加，说明黄曲霉的侵染会降低雪茄烟的香气成分含量，并且抑制类胡萝卜素、西柏烷类降解及美拉德反应的发生，而菌株CC-3 的添加减少了黄曲霉侵染的同时提高了香气成分含量。

图7 不同处理发酵第15 天与第30 天的香气成分Fig. 7 Different aroma compounds between 15 d and 30 d fermentation treatments

3 讨 论

本研究从雪茄烟发酵烟叶霉变组织中分离获得病原菌，通过形态学观察发现其菌落颜色形态与黄曲霉菌落形态类似，经柯赫氏法则检验发现原病原菌与柯赫氏试验分离病菌高度相似，经ITS 基因分子鉴定和相似性比对，确定2 种病原菌为黄曲霉菌属。经霉变防效测定发现一株蜡样芽孢杆菌CC-3可以有效防治雪茄烟发酵霉变。蜡样芽孢杆菌所产生的芽孢可在高温、弱酸和弱碱等相对极端环境下生存，具有很强的抗逆性[17]，可作为生防菌用于防治植物病虫害。本研究将离心菌体喷雾至雪茄烟叶进行发酵，经发酵期间测温，发酵最高温度可达55 ℃，而发酵结束后，仍取得较好的防治效果，烟叶霉变率下降了52.66%，说明蜡样芽孢杆菌不仅能在较高温度下存活，还能发挥较强的抑菌作用，符合蜡样芽孢杆菌的耐高温特性。目前蜡样芽孢杆菌被广泛应用于生物防治，成为目前生防菌研究的重要对象[18]，但在雪茄烟叶防霉问题上尚少见报道。

雪茄烟发酵可以使烟叶内各种化学成分更加协调，进而提高烟叶质量[19]。在烟叶发酵过程中合理有效地利用微生物资源的代谢特点，添加有益微生物可以提高雪茄烟叶功能菌株的种类及数量从而促进烟叶内的生化代谢，降解淀粉、纤维素、蛋白质等大分子物质，实现针对性的增香提质，降低刺激性并减少有害物[20]。本研究利用具有生防功能的蜡样芽孢杆菌进行发酵，香气物质总量提高了28.96%，这可能与蜡样芽孢杆菌本身产酶特性有关，但香气变化的原因需进一步研究。

雪茄烟作为一种吸食性烟草产品，其安全性至关重要。蜡样芽孢杆菌已被证实是常见的食源性致病菌，其产生的毒素可引起腹泻、呕吐等症状[21]。但并非所有的蜡样芽孢杆菌都具毒理性，蜡样芽孢杆菌是否产生毒素主要取决于该菌是否携带毒力基因，具有编码毒素的能力。如李雁飞等[22]发现承德市餐饮食品中蜡样芽孢杆菌的检出率为10.4%，通过对分离的19 株蜡样芽孢杆菌进行毒力基因检测，发现携带毒理基因的菌株有14 株，有5 株并未携带。文英会等[23]从246 批饲料产品中分离蜡样芽孢杆菌，总体分离率为25.60%，发现蜡样芽孢杆菌Cereulide 毒素基因携带率为6.30%，混合型饲料添加剂中的蜡样芽孢杆菌Cereulide 毒素基因携带率为13.3%。近年来，随着人们对蜡样芽孢杆菌的深入研究，非致病性蜡样芽孢杆菌所具有的功效逐渐被人们所发现，并逐步应用在食品发酵工艺[24]。如Zhao等[25]发现一株蜡样芽孢杆菌YB-1表现出高产乙基己酸酯和低产丙醇的特性，其应用于浓香型白酒的传统酿造工艺中，可以改善浓香型白酒的风味和品质。本研究中利用蜡样芽孢杆菌CC-1 进行雪茄烟发酵能有效抑制霉变并提高香气成分，但CC-3 是否携带毒理基因尚未明晰，为更好地应用于雪茄烟防霉发酵工艺，后期将进行CC-3 毒理性研究，进一步评价该菌的致病性。

4 结 论

本研究从云南省玉溪市境内采集雪茄烟发酵霉变病病样，经组织分离、形态学和分子生物学鉴定以及柯赫氏法则试验，明确了雪茄烟发酵霉变病的病原为黄曲霉（A.flavus）。通过平板对峙法筛选获得1 株抑菌能力较强的蜡样芽孢杆菌。发酵试验结果表明，蜡样芽孢杆菌（B.cereus）CC-3 可大大降低黄曲霉的侵染率并提高雪茄烟香气成分含量。