生防菌BZ3 对烟草普通花叶病毒的生防效果及全基因组分析

刘 蕾，肖志鹏，周向平，肖艳松，蔡海林，李玲玲，梅斯钇，刘天波*，唐前君*

（1.湖南农业大学植物保护学院，长沙 410128；2.中国烟草总公司湖南省公司，长沙 410004）

烟草普通花叶病毒病（Tobacco mosaic virus，TMV）是危害烟草产量和品质的主要病害，每年因TMV 造成的经济损失高达1 亿美元[1]。

目前防治烟草普通花叶病毒病的主要方法是化学防治，但生产中有效的抗植物病毒制剂较少，防治效果不佳，田间防效大多在50%以下[2]。化学农药的过度使用带来的抗药性加剧、农药残留和环境污染等一系列问题受到人们普遍关注，生物防治越来越被重视[2]。利用微生物防治烟草普通花叶病毒病的研究越来越多，主要集中在生防细菌，如假单胞菌[3]、芽孢杆菌[4]以及黏质沙雷菌等[5]。TMV能够在土壤中存活较长时间，土壤中的TMV 是重要侵染源之一，因此，从土壤中分离土著微生物防治TMV 受到研究者们的重视。岳研[6]从土壤中分离筛选到8 株对TMV 枯斑具有抑制效果的芽孢杆菌，刘涛[7]从烟草根际土壤中分离的8 株产铁载体细菌能显著抑制TMV 的发生。同时，生防菌能通过分泌次生代谢产物和诱导植物产生抗病性实现生物防治，如贝莱斯芽孢杆菌能产生表面活性素[8]和铁载体[7]等次生代谢产物来诱导植株产生抗性。

本研究从烟草根际土壤中分离得到菌株BZ3，对其进行鉴定，评价生防效果，并通过全基因组测序及基因功能分析生防菌分泌次生代谢产物的潜力，以期为烟草普通花叶病毒病的防控积累更多的生物资源，为后期的开发应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 培养基 PDA 培养基：土豆200 g，葡萄糖20 g，去离子水定容至1 L，pH 调至7.0；LB 培养基：NaCl 10 g，胰蛋白胨 10 g，酵母提取物5 g，去离子水定容至1 L，pH 调至7.0（固体培养基则再加入15 g/L 琼脂粉）。

1.1.2 土壤样品 采自湖南农业大学烟草基地烟草普通花叶病毒病发病地区中健康植株的根际土壤。

1.1.3 毒源及烟草 供试毒源TMV 保存于湖南农业大学植物保护实习基地温室内。试验烟草为栽培烟草云烟87 和心叶烟，在育苗基质中培育至6 片真叶左右，备用。

1.1.4 病原菌 烟草赤星病菌（Alternaria alternata）、烟草黑胫病菌（Phytophthoranicotianae）、烟草靶斑病菌（Rhizoctoniasolani）、辣椒疫霉病菌（Phytophthoracapsica）、辣椒白绢病菌（Sclerotium rolfsii）和水稻纹枯病菌（Rhizoctoniasolani），保存于湖南农业大学植物病理学实验室。

1.2 生防菌株的分离纯化及活性检测

1.2.1 菌株分离 采用稀释分离法[9]从烟草根际土壤分离菌株，并将形态特征差异明显的单菌落划线纯化3 次后，取单菌落移至5 mL LB 液体培养基中，37 ℃、200 r/min 培养14 h，将50%甘油和菌液以体积比1∶1 混合，-80 ℃保存备用。

1.2.2 菌株抑制活性筛选 分离得到的菌株于LB平板上划线活化3 次，挑取单菌落接种于20 mL LB培养基中，37 ℃、200 r/min 培养60 h（OD600约为2.0），10 000 r/min、4 ℃离心20 min，取上清液经0.22 μm 针孔式无菌过滤器过滤得到无菌发酵液。

称取1 g TMV 感病叶片，在研钵中加入适量石英砂研磨成匀浆，加0.2 mol/L 磷酸缓冲液定容至100 mL 制得TMV 接种液。参照林中正等[10]半叶枯斑法对菌株进行活性测定，左半边叶片接种LB 液体培养基与TMV 接种液1∶1 混合液为对照，右半边叶片接种菌株无菌发酵液与TMV 接种液1∶1 混合液。每个菌株接种3 株烟株，每株接种3 片叶片。接种0.5 h 后，用无菌水将叶片表面的石英砂轻轻冲掉，并在早晚各喷无菌水一次。3 d 后统计枯斑数量，参照赵誉强等[11]方法计算抑制率。

抑制率（%）=（对照组枯斑数-处理组枯斑数）/对照组枯斑数×100%

1.3 生防菌株鉴定

1.3.1 形态学鉴定 参照《常见细菌系统鉴定手册》[12]进行形态学鉴定。将筛选到的抑制效果最好的菌株BZ3 用划线分离法接种到LB 平板，30 ℃培养48 h，观察单菌落的形态特征，并进行革兰氏染色，干燥后显微镜观察并拍照记录。

1.3.2 生理生化鉴定 参考《伯杰细菌鉴定手册》[13]进行生理生化鉴定，每个处理重复3 次，并设置空白对照。

1.3.3 分子生物学鉴定 按照细菌基因组DNA 提取试剂盒（购自北京全式金生物公司）方法提取细菌基因组。以基因组DNA 为模板，参考王雯丽[14]和Wang 等[15]菌株鉴定中使用的引物对27F/1492R和BS-F/BS-R 扩增16S rRNA 和DNA 促旋酶B 亚基基因（DNA gyrase B subunit gene,gyrB）片段。扩增程序参考Wang 等[15]的方法，将PCR 产物送至上海生工生物工程股份有限公司测序。利用Mega X构建系统发育树，结合16S rRNA 和gyrB序列系统发育树确定菌株分类地位。

1.4 菌株BZ3 对TMV 的防效试验

1.4.1 温室盆栽试验 设置4 个处理，分别为BZ3菌株发酵液（2.0×109cfu/mL）、20%盐酸吗啉胍可湿性粉剂、10%超敏蛋白微颗粒剂，无菌水为对照，农药的施用量均为商品推荐最佳用量，每个处理3次重复。选择长势大小基本一致的6 叶期健康烟苗移栽到花盆，移栽时采用灌根方式处理1 次，每株5 mL。移栽7 d 后喷施处理叶片，每隔7 d 喷施1次，喷施3 次后，采用摩擦接种的方式将TMV 接种于烟草上。接种TMV 30 d 后调查发病率及病情指数，参照赵誉强等[11]方法计算发病率、病情指数和防治效果。

1.4.2 田间试验 在TMV 发病较重的龙山县茨岩镇试验基地，采用单因素完全随机区组设计，每个小区30 株烟，重复3 次。处理设置、接种TMV 处理及调查统计方法同1.4.1。

1.5 菌株BZ3 抑菌谱测定

利用实验室保存的6 种病原菌对菌株BZ3 进行广谱抑菌能力测定。按照1.2 方法获得菌株BZ3 的无菌发酵液，在100 mL PDA 培养基中加入20 mL无菌发酵液，混合均匀制成平板。将6 种病原菌分别接种于上述PDA 平板中央，以不加无菌发酵液的PDA 平板为对照，每个处理3 次重复。30 ℃恒温培养7 d 后，测量菌落直径，并计算抑菌率。

抑菌率(%)=（对照平板菌落直径-处理平板菌落直径）/对照平板菌落直径×100

1.6 全基因组测序和功能预测

提取菌株BZ3 基因组DNA，送武汉未来组生物科技有限公司进行全基因组测序。利用Nanopore 对菌株BZ3 基因组DNA 进行建库、测序。测序得到的原始reads 经过质控筛选、去接头后，利用NextDenovo 进行基因组组装、环化，得到菌株BZ3 基因组完整序列。

利用Prodigal 2.6.3[16]预测编码序列，利用blastx算法将基因组数据与NCBI 非冗余（NR）、COG（Clusters of Orthologous Groups）等数据库比较，并进行基因功能注释分析。利用tRNAscan-SE[17]、RNAmmer[18]和antiSMASH 2.0 等数据库对tRNA、rRNA 以及次生代谢产物进行预测。

1.7 数据统计与可视化分析

采用Excel 2016 和SPSS 23.0 软件进行数据处理和分析，通过GraphPad Prism 9 和ChiPlot 对试验数据和基因功能注释结果进行可视化分析；利用Proksee 进行全基因组图谱的绘制。

2 结 果

2.1 生防菌株的分离及其活性鉴定

从根际土壤中共分离得到菌株61 株，半叶枯斑法筛选获得对TMV有抑制活性菌株5株（表1），其中抑制效果最好为菌株BZ3（图1），抑制率达95.12%。

图1 菌株BZ3 对TMV 的抑制作用Fig. 1 Antagonistic effects of strain BZ3 on TMV

表1 生防菌株对TMV 的抑制作用Table 1 The inhibitory effect of biocontrol strains on TMV

2.2 生防菌株鉴定

2.2.1 形态学鉴定 菌株BZ3 在LB 平板上初期为透明水渍状、较为粘稠，约培养16 h 后为不规则的白色不透明菌落，表面有凸起褶皱，呈放射状（图2a）。革兰氏染色为阳性，菌体有鞭毛和荚膜，内生芽孢，芽孢长椭圆形，在扫描电镜下为短杆状，大小为（0.7～1.2） μm×（1.4～2.50）) μm（图2b-e）。

图2 菌株BZ3 的菌落形态(a)、革兰氏染色(b)、荚膜染色(c)、芽孢染色(d)及电镜观察形态(e)Fig. 2 Colony morphology (a), gram staining (b), capsule staining (d), spore staining (e) and electron microscope observation(e)of the BZ3 strain

2.2.2 生理生化鉴定 生理生化特性试验结果如表2所示。淀粉水解、革兰氏染色、甲基红试验、接触酶试验、明胶液化和V.P试验呈阳性，其他则呈阴性。

表2 菌株BZ3 的生理生化特性Table 2 Physiological and biochemical characteristics of bacterial strain BZ3

2.2.3 分子生物学鉴定 菌株BZ3 的16S rRNA 和gyrB基因序列提交至国家微生物科学数据中心，分别获得序列号NMDCN00016NQ和NMDCN00016NR。根据16S rRNA 基因序列构建的系统发育树（图3），菌株 BZ3 没有独立分支，与枯草芽孢杆菌（OL824905.1）、解淀粉芽孢杆菌(KJ009435.1)和贝莱斯芽孢杆菌(CP026039.1)的亲缘关系接近，同源性72%。基于gyrB基因构建的系统发育树（图4），菌株BZ3 的gyrB基因序列与贝莱斯芽孢杆菌BY6(NC CP051011.1)和LPL061(NC CP042271.1)在一个分支上，同源性100%。因此，根据形态学、生理生化试验和系统发育树，将菌株BZ3 鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillusvelezensis）。

图3 基于16S rDNA 序列的菌株BZ3 系统发育树Fig. 3 Phylogenetic tree of strain BZ3 based on 16S rDNA sequence

图4 基于gyrB 基因序列的菌株BZ3 系统发育树Fig. 4 Phylogenetic tree of strain BZ3 based on gyrB gene sequence

2.3 菌株BZ3 对TMV 的防治效果

菌株BZ3 无菌发酵液对TMV 有较好的防治效果，盆栽和田间的防效分别为58.97%和72.07%（表3），该防效明显高于盐酸吗啉胍可湿性粉剂和超敏蛋白微颗粒剂。

表3 菌株BZ3 对TMV 的防治效果Table 3 Effects of strain BZ3 on TMV

2.4 抑菌谱测定

菌株BZ3 具有广谱抗性，对水稻纹枯病菌、烟草靶斑病菌和烟草黑胫病菌等6 种病原菌均有拮抗作用，抑制率达到38%～100%（图5）。

图5 菌株BZ3 对供试病原菌的拮抗作用Fig. 5 Antagonistic effects of strain BZ3 on pathogens

2.5 全基因组测序和功能预测

2.5.1 全基因组测序分析 菌株BZ3 全基因组测序结果显示基因组含4 条congtig，contig N50 为2 542 938 bp，GC 含量为46.5%，无不确定碱基，拼接结果完整性较好，基因组覆盖度大于99.62%，包含3975 个蛋白编码序列（CDSs）、146 个rRNA、39 个tRNA，以及47 个其他非编码RNA。COG 结果分析显示，BZ3 基因组中有72.51%的基因功能得到了注释，丰度最大的是参与氨基酸转运代谢的基因，有343 个基因被COG 数据库注释为未知功能基因（图6）。

图6 贝莱斯芽孢杆菌BZ3 的基因组圈图Fig. 6 Circular genome map of Bacillus velezensis BZ3

2.5.2 次生代谢产物基因簇分析 通过antisSMASH 预测，菌株BZ3 基因组中含有18 个次生代谢产物合成相关的基因簇，其中包括3 种通过非核糖体合成酶（NRPSs）合成的脂肽类活性物质即表面活性素（surfactin）、丰原素（fengycin）和铁载体（bacillibactin），4 种通过聚酮合成酶（PKS）合成的聚酮类化合物即大环素内酯H（macrolactin H）、杆菌素（bacillaene）、地非西丁（difficidin）和丁苷菌素A/B（Butirosin A/B），以及一些未知功能的化合物。

表4 次级代谢产物合成基因簇注释分析Table 4 Annotation analysis of secondary metabolite synthesis gene clusters

3 讨 论

TMV 具有很强的抗逆性，在土壤、病叶残体和烘烤过的烟草病叶中均能存活数年。TMV 的初侵染主要来源于土壤和田间病残体的TMV 病毒粒子[19]，从土壤中筛选生防菌株防治TMV 受到越来越多研究者们关注。吴惠惠等[20]和郭丛等[21]从烟田土壤中筛选出对TMV 有显著拮抗活性的荧光假单胞菌株CZ（Pseudomonasfluorescens）和恶臭假单胞菌（Pseudomonasputida）A3。本研究从烟草根际土壤中筛选得到贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）BZ3，可以抑制TMV，具有防治TMV的潜在应用价值。

贝莱斯芽孢杆菌是一种重要的生防菌，对TMV有较好的防效，且具有广谱抗性。申莉莉等[4]从土壤中分离的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）by33 对TMV 的体外钝化作用高达85.35%；厉彦芳等[22]筛选的侧孢短芽孢杆菌（Brevibacilluslaterosporus）B8 菌株发酵液对TMV的抑制率为87.52%。本研究筛选的贝莱斯芽孢杆菌BZ3 无菌发酵液对TMV 的抑制率高达95.12%，高于解淀粉芽孢杆菌by33[4]和侧孢短芽孢杆菌B8[22]。此外，菌株BZ3 发酵液对TMV 的田间防效高达72.07%，高于王盼等[23]研究的YNLP-2 菌株的田间防效，且其防治效果显著高于生产上的常用药剂盐酸吗啉胍和超敏蛋白。此外，菌株BZ3 具有防治真菌和细菌病害的广谱生防潜能，其无菌发酵液对水稻纹枯病菌、烟草靶斑病菌、烟草赤星病菌和辣椒白绢病菌等多种病菌具有优良的拮抗效果，抑制率达83%～100%，具有广阔的应用前景。

贝莱斯芽孢杆菌能够分泌脂肽类和聚酮类等抗生素，具有杀灭病原菌、提高植物抗性和阻碍植物病原菌对植物的侵染等作用。Long 等[24]研究发现表面活性素在一定浓度下，可以侵入囊泡生物（如病毒、细菌和真菌）的外层脂质结构，并使其结构瓦解，从而达到灭杀病原微生物的目的。刘涛等[7]发现铁载体对烟草具有促生作用，能够显著提高烟株的抗病毒能力。Jin 等[8]和谢菁菁[25]发现纯化的表面活性素在烟草细胞悬浮液中可触发防御反应，诱导植物产生系统抗性来抵抗TMV。厉彦芳等[26]研究表明侧孢短芽孢杆菌产生的BLB8 蛋白能破坏TMV 的粒子形态，推测是芽孢杆菌产生了某种类似于BLB8 蛋白的活性物质，使TMV 结构发生改变，从而失去侵染能力。本研究对BZ3 全基因组测序和基因功能分析发现，其基因组中含有18个次生代谢产物合成相关基因簇，其中包括了表面活性素、丰原素、大环素内酯和铁载体等多种具有抑菌活性的物质，推测菌株BZ3 产生了表面活性素等活性物质，同时触发了植物防御反应，减弱了TMV 的侵染能力，从而对TMV 有优良的生防效果。贝莱斯芽孢杆菌BZ3 含有多种抑菌活性的次生代谢产物基因簇，但本研究未对活性物质进一步分离纯化，下一步将结合代谢组学和核磁共振等技术，进一步分离纯化和鉴定，并深入研究其抗病机理，为生防菌的开发提供理论支撑。

4 结 论

本研究从烟草根际土壤筛选获得对TMV 具有抑制作用的生防菌株贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）BZ3，对TMV 的防效较好，抑菌谱较广，基因组中含有多种抑菌抗病毒活性的次生代谢产物基因簇，具有较好的应用前景。