广东韶关烟区烟草镰刀菌根腐病病原鉴定及致病性分析

沈会芳，邓海滨，杨祁云，张景欣，曾 涛，蒲小明，孙大元，林壁润*

（1.广东省农业科学院植物保护研究所，广东省植物保护新技术重点实验室，广州 510640；2.广东省烟草科学研究所，广东韶关 512026）

镰刀菌根腐病是严重危害烟草的根茎病害之一，能够造成烟叶大幅减产，甚至绝收。根腐病菌种类复杂，不同地区的致病镰刀菌种类不同，同一地区烟草根腐病也可由1 种或多种镰刀菌引起。Lamondia[1]报道尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum）是美国康涅狄格和马萨诸塞州的雪茄烟致病菌。云南鉴定有F.oxysporum[2]、茄病镰刀菌（F.solani）[3]和轮枝镰刀菌（F.verticillioides）[4]。河南烟区病原菌有F.oxysporum、F.solani、层出镰刀菌（F.proliferatum）和F.sinensis[5-6]。为有效防治该病害，需要首先明确该地区致病镰刀菌的种类和致病性。

广东韶关烟区以种植浓香型优质烟草为主，多年来，镰刀菌根腐病零星发生，属次要病害，但2022年3—7 月间，韶关降雨量明显高于往年，烟草根腐病突然爆发成灾，受害烟田达10%～15%，上升为主要病害，有关广东省烟区侵染烟草的镰刀菌种类未见报道。为有效防治该病害，本研究对韶关烟草根腐病菌进行分离纯化，测定其致病力，以病菌形态特征与分子技术相结合鉴定病原菌，为生产中有效防治该病害提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

病害样本于2022 年3—7 月采自广东韶关市的始兴、南雄、乌茎和珠玑4 地。供试烟草：粤烟97，由广东省烟草科学研究所提供。培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（PDA），马铃薯葡萄糖培养液（PDB）。

1.2 试验方法

1.2.1 病害调查及病原菌分离 在广东韶关的始兴、南雄、乌茎、珠玑进行病害调查。采用5 点取样法，每点调查10 株烟株，记录发病情况，计算发病率，拍照记录病害症状。采集发病烟株，将病株根茎部用流水洗净，晾干，从病健交界处切取约4 mm 见方的小块病组织，参照方仲达[7]的常规组织分离方法，表面消毒后接种到PDA 平板，26 ℃培养5 d，挑取菌落边缘菌丝接种到PDA 上培养，单孢分离获得纯化菌株。4 ℃保存备用。

1.2.2. 菌株形态特征观察 将待测菌接种到PDA上，26 ℃培养，每24 h 观察记录菌落直径、形态和颜色变化等。培养6 d 后，制片，观察菌丝、孢子、分孢梗的颜色、形态，有无厚垣孢子产生，测量大型和小型分生孢子的大小（n=50）。参考前人文献初步鉴定病原菌。

1.2.3 菌株的分子鉴定 将待测菌接种于PDB 培养液，26 ℃、150 r/min 培养3 d 后收集菌丝，采用uniq-10 柱式真菌基因组DNA 抽提试剂盒提取基因组DNA。用ITS（ITS1 和ITS4）[8]、EF-1α（EF1和EF2）[9]和β-Tub（β-tub T01 和β-tub T02）[10]通用引物进行PCR 扩增，20 µL 反应体系：100 ng/µL DNA 模板1 µL、50 µmol/L 正向反向引物各1 µL、2×PCR Mix 预混液8.5 µL、ddH2O 8.5 µL。条件为：94 ℃预变性10 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共34 个循环；72 ℃延伸10 min。扩增产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将测得的序列在NCBI 上做BLAST比对，提取GenBank 中相近的序列，用Mega 7.0软件进行序列比对，构建基于EF-1α 和β-Tub 序列的Neighbor-Joining 系统发育树，根据分离菌株与已知菌株的亲缘关系确定病原菌的分类地位。

1.2.4 菌株致病性测定 参照邱睿等[11]方法，把待测菌株接种于灭菌麦粒上，26 ℃培养7 d，制成带菌麦粒培养物。取100 g 灭菌土，接入带菌麦粒（每钵接30 粒），拌匀，施足水后移入4～5 叶龄的健壮烟苗，每盆1 株，置于26 ℃温室保湿培养。以拌入无菌麦粒为对照，每处理10 盆，3 次重复。接种后每天观察各处理发病情况，处理后3、5、7 d，调查发病情况，计算发病率和病情指数。根腐病分级调查标准参考《烟草病虫害分级及调查方法》（GB/T 23222—2008）[12]：0 级，植株生长正常；1级，植株基本生长正常或稍矮化，最下部叶片黄化或萎蔫；3 级，病株比健株矮1/4～1/3，1/2～2/3叶片黄化或萎蔫；5 级，病株比健株矮1/3～1/2，2/3 以上叶片黄化或萎蔫；7 级，病株比健株矮1/2以上，全株叶片黄化或萎蔫；9 级，病株基本枯死。病情指数=∑（病级数值×该病级植株数）/（最高级数×调查总植株数）×100。烟株出现症状后，进行病原菌再分离，观察分离物形态。

1.2.5 数据统计与分析 采用DPS 软件处理，用邓肯氏新复极差多重比较法进行差异显著性分析。

2 结 果

2.1 病害调查及样本分离

分离病原菌，获得49 株真菌，通过ITS 序列比对分析，其中45 株为镰刀菌。采用ITS 序列在NCBI 上进行BLAST 比对时，部分菌株比对结果混乱，无法明确到种，因此，ITS 序列仅用于菌株的初步分类。结合各菌株外部形态特征及ITS 序列分析，将45 株镰刀菌初步分为4 类（表1），每类随机选取1～2 株，进行形态特征描述、系统发育分析和致病力测定。

表1 分离菌株情况Table 1 List of isolated strains

Ⅰ类菌株占比最大，为42.22%，广泛分布在南雄、始兴、乌茎和珠玑4 地，采集地发病率较轻，为6.00%～18.00%。Ⅱ类菌株和Ⅲ类菌株均分布于始兴和南雄，采集地发病率较重，分别为28.00%～66.00%和24.00%～60.00%。Ⅳ类菌株仅分布于乌茎，采集地发病率较轻。可见，I 类菌株为广东韶关烟区的优势菌株，而Ⅱ类菌株和Ⅲ类菌株采集地的发病率明显偏重。

2.2 4 类镰刀菌的形态特征

19 株I 类菌株形态特征相似，代表性菌株SGF4和SGF12在PDA上的生长速度为9.00和9.67 mm/d。菌落白色，气生菌丝稀疏，薄绒状，菌落背面无色，不产色素（图1）。分生孢子梗较长，产孢细胞瓶梗状，多单生。大型分生孢子2～4 个隔膜，多数为3个隔膜，马特形，较宽，两端略向内弯曲，顶细胞圆锥形，基细胞钝圆，大小为(12.29～32.45) µm×(3.52～5.64) µm。小型分生孢子在产孢细胞顶端聚集成假头状，纺锤形、梭形，无隔膜，大小为(5.58～13.26) µm×(2.45～4.05) µm。未见厚垣孢子。比对文献[13-14]，初步鉴定为茄病镰刀菌（F.solani）。

图1 Fusarium solani 的形态特征Fig. 1 Morphological characteristics of Fusaium solani

12 株Ⅱ类菌株形态特征相似，代表性菌株SGF25 和SGF29 在PDA 上的生长速度为15.67 和14.33 mm/d（图2）。菌落外围白色，内圈粉红色，气生菌丝棉絮状，丰富，菌落背面白色到肉色。产孢细胞瓶形或安瓿瓶形，短，多单生。大型分生孢子3～6 个隔膜，美丽形，孢子细长，腹背平行，顶细胞为细锥形，有喙，大小为(18.04～41.45) µm×(2.86～4.62) µm。小型分生孢子纺锤型或肾形，0～1个隔膜，大小为(4.56～12.48) µm×(2.25～3.62) µm。具厚垣孢子，球形。比对文献[13，15]，初步鉴定为共享镰刀菌（F.commune）。

图2 Fusarium commune 的形态特征Fig. 2 Morphological characteristics of Fusarium commune

9 株Ⅲ类菌株形态特征相似，代表性菌株SGF36 在PDA 上的生长速度为13.67 mm/d（图3）。菌落白色，气生菌丝棉絮状，丰富，表面粗糙，菌落背面为粉红色。产孢细胞瓶梗状，短，多单生。大型分生孢子美丽形，细长，较直，两端稍弯曲，3～5 个隔膜，顶细胞细圆锥形，具喙，基细胞具足跟，大小为(18.54～45.85) µm×(2.35～3.84) µm。小型分生孢子在产孢细胞顶端聚集成假头状，长纺锤形、棒形或卵形，0～1 个隔膜，大小为(5.56～16.76) µm×(2.32～3.86) µm，未见厚垣孢子。比对文献[16]，初步鉴定为藤仓镰刀菌（F.fujikuroi）。

图3 Fusarium fujikuroi 的形态特征Fig. 3 Morphological characteristics of Fusarium fujikuroi

5 株Ⅳ类菌株形态特征相似，代表性菌株SGF43 在PDA 上的生长速度为9.33 mm/d（图4）。菌落外围白色，内圈淡粉红色，气生菌丝薄绒状，菌落背面粉红色。产孢细胞瓶梗状，短，单生。大型分生孢子美丽形，腹背平行，细长，2～5 个隔膜，多为3 个隔膜，顶细胞为细锥形，足跟不明显或钝圆，大小为(20.24～32.62) µm×(2.26～3.88) µm。小型分生孢子椭圆形，纺锤形或肾形，0～1 个隔膜，极少具2 个隔膜，隔膜处略有缢缩，大小为(4.24～12.56)µm×(2.84～4.65) µm。未见厚垣孢子。比对文献[13-14]，初步鉴定为尖孢镰刀菌（F.oxysporum）。

图4 Fusarium oxysporum 的形态特征Fig. 4 Morphological characteristics of Fusarium oxysporum

2.3 4 类镰刀菌的分子生物学鉴定

利用EF-1α 和β-Tub 通用引物对菌株进行PCR扩增，获得片段长度在750 bp 和1300 bp 左右。用EF-1α 和β-Tub 序列在NCBI 上进行BLAST 比对，结果均较稳定。基于EF-1α 序列构建系统发育树，见图5，基于β-Tub 序列构建系统发育树，见图6，同时采用TEF-1α 和β-Tub 序列联合构建系统发育树，见图7。SGF4 和SGF12 均与F.solani聚为一支，SGF25 和SGF29 均与F.commune聚为一支，SGF36 与F.fujikuroi聚为一支，SGF43 与F.oxysporum聚为一支。且基因序列一致性均在99%以上。

图5 基于EF-1α 序列构建的系统发育树Fig. 5 Phylogenetic tree based on EF-1α sequences

图6 基于β-Tub 序列构建的系统发育树Fig. 6 Phylogenetic tree based on β-Tub sequences

图7 TEF-1α 和β-Tub 序列构建的系统发育树Fig. 7 Phylogenetic tree based on TEF-1α and β-Tub sequences

结合4 种类型菌株的培养特征、形态特征和系统发育分析，鉴定菌株SGF4 和SGF12 是茄病镰刀菌（F.solani），SGF25 和SGF29 是共享镰刀菌（F.commune），SGF36 是藤仓镰刀菌（F.fujikuroi），SGF43 是尖孢镰刀菌（F.oxysporum）。

2.4 4 类镰刀菌对烟草的致病性测定

4 类镰刀菌对烟苗的致病性测定显示，F.solaniSGF4、F.solaniSGF12 和F.oxysporumSGF43 处理后，烟苗未表现萎蔫症状，但烟苗矮小，叶片由下至上黄化（图8-A、8-B、8-C）。F.communeSGF25、F.communeSGF29 和F.fujikuroiSGF36 处理后第2天，烟苗下部叶片开始萎蔫，随着病情的发展，叶片由下至上黄化萎蔫，植株矮小（图8-D、8-E、8-F）。

图8 4 类镰刀菌对烟苗的致病性（处理后7 d）Fig. 8 Pathogenicity of 4 types of Fusarium to tobacco seedlings（7 d post treated)

处理7 d 后拔出病株，F.solaniSGF4、F.solaniSGF12 和F.oxysporumSGF43 处理的根变黑，有侧根但与对照相比较少（图8-G）。F.communeSGF25、F.communeSGF29 和F.fujikuroiSGF36 处理根部变黑、腐烂，但几乎无侧根。综上，不同类型镰刀菌对烟苗均有致病性，其二次分离物与接种菌株均一致，确定4 类菌株均为烟草根腐病的致病菌。

从表2 可见，随着处理时间的增加，F.communeSGF25、F.communeSGF29、F.fujikuroiSGF36 和F.oxysporumSGF43 侵染的烟苗病情指数明显上升，病害发展迅速，处理后第7 天，病情指数分别为70.00、72.00、63.67 和52.00，烟株严重受害，已无经济价值（图9）。F.solaniSGF4 和F.solaniSGF12 侵染的烟苗病情指数上升平缓，虽然下部叶片黄化，但烟株一直可生长，具有一定的经济价值，处理后第7 天的病情指数为36.67 和32.00。综上，4 类镰刀菌对烟草均有致病性，致病力强弱排序为F.commune≈F.fujikuroi＞F.oxysporum＞F.solani。

图9 4 类镰刀菌对烟苗生长的影响（处理后7 d）Fig. 9 Effects of 4 types of Fusarium on the growth of tobacco seedlings（7 d post treated)

表2 4 类镰刀菌处理后烟苗的病情指数Table 2 The disease index of tobacco seedlings treated with 4 types of Fusarium

3 讨 论

多种镰刀菌可侵染烟草引起根腐病，不同地区的致病镰刀菌种类不同，其中F.oxysporum或F.solani一直是各地烟草镰刀菌根腐病的优势致病菌。邱睿等[17]报道河南烟草根腐病菌有4 种，以F.oxysporum为主，占81.25%。盖晓彤等[18]鉴定云南烟草根腐病病原有7 种镰刀菌，其中F.oxysporum为优势菌。而桑维钧等[19]鉴定贵州烟草根腐病菌以F.solani为主。马来西亚的主要致病菌也是F.solani[20]。本研究鉴定广东韶关烟区致病菌有4 种，分别为F.solani、F.commune、F.fujikuroi和F.oxysporum。其中F.solani分布区域最广，分离菌株数量最多，占比42.22%，为优势种群。虽然F.solani在韶关烟区分布最广，但在4 种致病镰刀菌中，该菌致病性最弱，采集地发病率较轻，为6.00%～18.00%，致病性测定表明，烟株被侵染后，下部叶片变黄，但烟苗一直可生长，仍有一定的经济价值。这也解释了韶关烟区2022 年以前虽然每年有根腐病发生，但发病率一直较低，危害较轻，属次要病害的原因。

但2022 年3—7 月，烟草根腐病在南雄和始兴突然暴发，受害烟田面积达10%～15%，发病率在20%以上，严重的高达60%，且发病速度快，植株受害严重，最后全株枯萎，无任何经济价值，可见其病原菌致病能力较强。从南雄和始兴重病烟株上分离出F.commune和F.fujikuroi两种镰刀菌致病力均较强，接种烟苗7 d 病情指数均在63%以上，短期内可致烟苗黄化枯萎死亡。因此判断造成南雄和始兴烟草根腐病暴发的病原菌主要是F.commune和F.fujikuroi。本研究发现，F.commune和F.fujikuroi生长速度较快，在PDA 上生长速度均在13.00 mm/d 以上，当带菌麦粒接种在土壤中，仅3 d即在土壤表面出现大量白色菌丝。而2022 年上半年，韶关烟区雨量丰富，高于往年，土壤湿度一直较大，两种镰刀菌在土壤中大量增殖积累，侵染烟草，最终爆发成灾。

F.fujikuroi是一类重要致病镰刀菌，可侵染多种重要经济作物，引起水稻恶苗病[21]、玉米茎腐病[22]、大豆种腐病[23]等，造成重大经济损失。邱睿等[5]虽然在河南烟区检测出F.fujikuroi，但并未明确其是否具有致病性，本文明确了F.fujikuroi能够侵染烟草引起根腐病。

4 结 论

本研究以镰刀菌的形态特征为基础，结合基于EF-1α 和β-Tub 序列构建的系统发育树明确了广东韶关烟草镰刀菌根腐病菌有4 种，为茄病镰刀菌（F.solani）、共享镰刀菌（F.commune）、藤仓镰刀菌（F.fujikuroi）和尖孢镰刀菌（F.oxysporum），4 类镰刀菌对烟草致病性强弱排序为F.commune≈F.fujikuroi＞F.oxysporum＞F.solani。F.solani分布较广，是广东韶关烟区的优势种群。本研究明确广东韶关烟草根腐病菌的病原菌种类及致病性强弱，可为生产中防治该病害提供依据。