Wilson病认知功能障碍与肠道菌群的相关性研究

沈 奇,王艳昕,朱晶晶,文 曼,束道贤,王 颖,孙 敏

(1.安徽中医药大学第一附属医院脑病科,安徽 合肥 230031;2.安徽中医药大学研究生院,安徽 合肥 230012;3.淮南联合大学,安徽 淮南 232038;4.安徽大学,安徽 合肥 230601)

Wilson病(Wilson’s disease,WD)是一种罕见的先天性铜代谢障碍的常染色体遗传病,由位于人染色体13q14.3上ATP7B基因变异所致,表现出神经症状、精神异常、肝功能异常、角膜K-F环等症状[1]。近年来研究[2]发现,认知功能障碍作为WD的非运动症状之一,表现为执行功能、记忆力、注意力障碍,影响患者正常生活。WD脑型多因铜离子存积于大脑各处,尤其是基底节区,损伤基底节—丘脑—皮质环路,影响认知功能[3]。但是有部分研究表明,认知功能障碍并非完全与铜离子在脑的沉积有关,提示WD的认知功能障碍还有更复杂的原因。相关研究[4]表明,WD患者代谢紊乱导致肠道功能失调,影响肠道菌群的多样性。肠道菌群对人体脑功能、情绪以及行为等具有调节作用,其功能失调容易引起帕金森病、精神分裂症、阿尔茨海默病和脑卒中等神经、精神疾病[5]。目前,尚未有对WD的认知功能障碍与肠道微生物多样性的研究。基于肠道菌群与WD的相关性,本研究运用16S rRNA基因测序技术对WD认知功能障碍患者和WD无认知功能障碍患者的粪便进行检测,分析WD认知功能障碍与肠道微生物类型是否存在相关性,以期为临床诊疗WD伴认知功能障碍提供思路及参考。

1 临床资料

1.1 诊断标准

1.1.1 WD西医诊断标准 参照《肝豆状核变性诊断和治疗指南》[6]:按照锥体外系体征或有肝脏损害病史,合并24 h尿铜>100 μg,或铜蓝蛋白<200 mg/L,或肝铜含量>250 μg/g,K-F环阳性便可确诊;若铜蓝蛋白正常或K-F环阴性,而两条染色体均携带ATP7B基因致病变异等明确诊断。

1.1.2 认知功能障碍诊断标准 参照《中国精神障碍分类与诊断标准》中相关标准[7],并结合临床症状拟定认知功能障碍诊断标准:①记忆力受损超出根据年龄与教育的期望值;②有客观的证据显示存在短期和(或)长期的记忆损伤;③整体的认知能力降低;④有抽象思维损害和(或)判断障碍;⑤经医师通过认知量表检测,可明确其存在认知功能障碍;⑥日常生活能力下降。

1.2 纳入标准 ①确诊WD者。②观察组蒙特利尔认知评估(Montreal cognitive assessment,MoCA)量表认知评分<26分,受教育年限≤12年,可将结果加1分;对照组MoCA量表认知评分≥26分,受教育年限≤12年,可将结果加1分,但总分不能超过30分。③首次就诊患者或近3个月未服用治疗WD的相关药物及改善认知功能的药物。④年龄13～65岁。⑤患者及其家属知情同意。

1.3 排除标准 ①年龄>65岁或<13岁;②严重肝功能异常、脑梗死、恶性肿瘤、凝血功能异常、免疫功能异常、心血管疾病患者;③入组前1个月曾服用治疗WD的药物及改善认知功能的药物;④颅脑MRI检查可见额叶皮质下对称性受累,显示双侧T2高信号影;⑤患者拒绝签署知情同意书。

1.4 一般资料 筛选2017年6月至2018年12月在安徽中医药大学第一附属医院脑病科住院且满足纳入标准的WD患者,调查所有患者的基本情况,且做好数据统计工作,即患者的年龄、性别、既往史、家族史、饮食情况以及过敏史等内容。根据纳入和排除标准,应用MoCA量表筛查满足认知功能障碍诊断标准的WD患者作为观察组,MoCA量表评分正常且满足纳入标准的WD患者作为对照组。 共纳入对照组32例、观察组患者38例。对照组:男16例,女16例;平均年龄(28.81±10.67)岁;平均受教育年限(9.91±3.19)年;统一Wilson病评分量表(unified Wilson’s disease rating scale,UWDRS)评分为(103.91±19.45)分。观察组:男19例,女19例;平均年龄(27.35±9.45)岁;平均受教育年限(9.39±3.14)分;UWDRS评分为(105.11±20.97)分。两组患者性别、年龄、UWDRS、受教育年限比较,差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性。 两组患者在入组前1个月未出现呼吸系统疾病,在收集样本的1周内未服用过任何药物。

2 方法

2.1 标本收集 收集两组患者的晨起大便样本(为了避免其他因素影响实验结果,全部待检者需在无菌区排便)3～4 g,然后将样本放入一次性便签盒中,密封后立即送至冷藏柜中冷藏待检。

2.2 粪便DNA抽提 取粪便样本0.2～0.3 g,放进存有预热溶液A的离心管中,震荡离心5～10 min后放入65 ℃水温中至少5 min;将样本所得的上清液与溶液B相互混合,然后将其置于离心管内冰浴5 min以上。然后离心3 min,将其转移到另外一个1.5 mL的离心管,管内上清液不得多于0.6 mL,然后将其添加到1.5倍的溶液C中,使其充分混合;随后将上柱分2次(将冲洗液分别加入柱内,离心1 min后除去穿透液),将其余的液体离心1 min,以便在DNA样品中清洗溶液。将该溶液移到另外一个离心管中,再加DNA洗脱液,1～2 min后进行最后一次离心,持续1 min,最终获得的DNA样本,放于-20 ℃冰箱中。所提取的总DNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测完整性。

2.3 PCR扩增 选择可变区的特定区段(V3～V4区),选用通用引物338F和806R对总DNA样品进行细菌16S rDNA序列片段扩增,引物序列:上下游引物806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)与338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′),经过27个循环,每一个样品进行3次重复,将重复样品中的PCR产物进行合并,初步检测浓度后用于后续高通量测序。

2.4 荧光定量和高通量测序 将PCR产物进行荧光定量检测,采用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统进行定量检测;依据定量结果和测序量要求,将PCR产物构建测序文库,通过第二代DNA高通量测序技术,使用Illumina Miseq PE300测序平台进行高通量测序。

2.5 生物信息学分析 将测序后得到所有序列基于聚类单元分析以及分类学分析,获得肠道菌群丰度及多样性,在门、科、属等生物分类水平上分析统计各样品的物种相对丰度。

3 结果

3.1 测序数据优化情况

3.1.1 DNA的序列长度 采用高通量测序系统,对两个组别的DNA样品进行比较,并选取12例子样品序列优化,得到1～520 bp的DNA序列长度,大部分DNA的序列长度为421～460 bp。见图1。

图1 样品序列长度分布

3.1.2 样本多样性分析 多样性指数为肠道菌群种类多样性的程度,均通过Alpha多样性分析而获得。其中Sobs指数表示观测到的物种数目,Simpson指数是物种丰富度的指标,即菌群中每个物种丰度的比例,其数值越大,代表菌群多样性越低;Shannon指数表示物种丰富度和均匀性的指标,数值越大代表菌群多样性越大。两组样本多样性指数比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组样本多样性比较

3.1.3 稀释曲线分析 稀释曲线是用来估计比较测序数据量不同样品中物种的丰度,可以对两组肠道菌群群落丰度进行深入对比,并且也用于检测样品测序量是否充足。稀释曲线斜率平滑、变化不大,提示测序数据量较为充足,测序深度基本包含样本中所有物种,每个样本中物种分布也相对均匀。两组稀释曲线斜率较为平滑,且两组测序的数据具有充分的合理性,可以为进一步的统计分析提供依据。见图2。

图2 两组稀释曲线

3.2 样品分组分析 非度量多维尺度(non-metric multidimensional scaling,NMDS)分析显示:两组微生物组成差异具有统计学意义(图3A)。通过相似性分析(analysis of similarities,ANOSIM )评估的肠道菌群结构在两组之间存在显著差异(R=0.650 5,P=0.009)。 主成分分析(principal component analysis,PCA)(图3B)和主坐标分析(principal co-ordinates analysis,PCoA)(图3C)表明两组患者的肠道微生物存在明显差异。

3.3 物种差异 组间物种差异研究,即对两个群落中不同种类进行监测,并进行假定检验,以评价其差异的显著程度。本研究样品的物种进行差异显著性分析,分别从门、科和属3个不同生物分类信息比较其相对丰度信息,以探讨肠道菌群和WD认知障碍的相关性。

3.3.1 两组门水平相对丰度比较 两组差异明显的物种有拟杆菌门(Bacteroidetes),分别占14.36%和48.78%;厚壁菌门(Firmicutes),分别占49.46%和32.02%;放线菌门(Actinobacteria),分别占1.21%和11.12%;变形菌门(Proteobacteria),分别占34.96%和8.08%。与对照组比较,观察组拟杆菌门和放线菌门丰度明显升高(P<0.05);厚壁菌门和变形菌门丰度明显降低(P<0.05)。见图4。

3.3.2 两组科水平菌群相对丰度比较 两组差异明显的物种有产碱杆菌科(Alcaligenaceae),分别占0.005%和5.224%;韦荣氏球菌科(Veillonellaceae),

注:A.NDMS分析;B.PCA分析;C.PCoA分析

分别占0.520%和4.693%;乳酸菌科(Lactobacillaceae),分别占0.005%和4.844%;紫单胞菌科(Porphyromonadaceae),分别占0.876%和3.828%;双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae),分别占0.251%和11.090%;理研菌科(Rikenellaceae),分别占0.415%和3.082%;拟杆菌科(Bacteroidaceae),分别占0.961%和41.840%;链球菌科(Streptococcaceae),分别占9.363%和0.071%;肠杆菌科(Enterobacteriaceae),分别占34.120%和2.391%;普氏菌科(Prevotellaceae),分别占11.450%和0.027%;毛螺菌科(Lachnospiraceae),分别占15.350%和14.720%;科里杆菌科(Coriobacteriaceae),分别占0.938%和0.018%;乳球菌科(Ruminococcaceae),分别占21.210%和7.396%;梭菌科(Clostridiaceae_1),分别占2.298%和0.018%;未分类拟杆菌(Bacteroidales_S24-7_group),分别占0.657%和0%。与对照组比较,观察组双歧杆菌科、紫单胞菌科、拟杆菌科、产碱杆菌科、理研菌科、乳酸菌科、韦荣氏球菌科丰度明显升高(P<0.05),梭菌科、科里杆菌科、未分类拟杆菌、肠杆菌科、毛螺菌科、乳球菌科、普氏菌科、链球菌科丰度明显降低(P<0.05)。见图5。

注:P值为Ae-b形式,为A×10-b次方值,其值远小于0.05

3.3.3 两组属水平菌群相对丰度比较 两组差异明显的物种有拟杆菌属(Bacteroides),分别占0.961%和41.840%;柯林斯氏菌属(Parabacteroides),分别占0.459%和3.648%;Lachnoclostridium,分别占0.237%和9.064%;乳球菌属(Ruminococcus_2),分别占0.037%和4.467%;帕拉斯氏菌属(Parasutterella),分别占0%和5.224%;双歧杆菌属(Bifidobacterium),分别占0.251%和11.090%;另枝菌属(Alistipes),分别占0.415%和3.082%;小杆菌属(Dialister),分别占0%和4.613%;乳酸菌属(Lactobacillus),分别占0.005%和4.844%;栖粪杆菌属(Faecalibacterium),分别占16.270%和1.599%;克雷伯氏菌(Klebsiella),分别占33.800%和0.049%;链球菌属(Streptococcus),分别占9.363%和0.071%;普雷沃氏菌属(Prevotella_9),分别占10.860%和0.014%;布劳特氏菌属(Blautia),分别占3.187%和1.973%;直肠真杆菌属([Eubacteri-um]_rectale_group),分别占5.047%和0.271%。与对照组比较,观察组乳酸菌属、小杆菌属、乳球菌属、柯林斯氏菌属、另枝菌属、拟杆菌属、双歧杆菌属、帕拉斯氏菌属丰度明显升高(P<0.05),直肠真杆菌属、布劳特氏菌属、克雷伯氏菌、栖粪杆菌属、普雷沃氏菌属、链球菌属丰度明显降低(P<0.05)。见图6。

注:P值为A e-b形式,为A×10-b次方值,其值远小于0.05

注:P值为Ae-b形式,为A×10-b次方值,其值远小于0.05

4 讨论

WD是一种铜代谢异常的常染色体隐性遗传病,临床主要以锥体外系症状及肝脏损害为主,除了以上损害外,认知功能障碍也十分常见[2]。在认知功能障碍的整个发展过程中,肠道微生物,如放线菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门起到重要作用[8]。但是关于WD合并认知功能障碍的研究较少,因此本研究在既往研究基础上,进一步对WD患者肠道菌群与认知的相关性展开研究。

中医理论认为人的意识、思维、情感等脑神的变化与腑气通畅关系密切,例如脑卒中后便秘就是脑神的改变影响肠腑气的通畅,便秘患者肠腑通降失常,腑气不通,上扰清窍,也可影响神明。脑与肠在生理、功能或病理上相互影响、相互制约。现代医学将肠道微生物与大脑之间的双向交流称为微生物群—肠—脑轴,涉及神经细胞发育、大脑功能和认知调节等方面[9]。现有研究[10-11]发现,肠道微生物主要通过以下两个方面影响认知功能:肠道微生物产生的代谢物(如短链脂肪酸、神经递质及其前体)通过影响大脑中相关代谢物水平,从而调节大脑功能和认知;肠道炎症以及肠道屏障功能失调,肠道通透性增加可能会导致神经退行性病变,影响认知功能。其中短链脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)包括乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐,是肠道微生物厚壁菌门、普氏菌科、普雷沃氏菌属、链球菌属和真杆菌属等代谢的主要产物[12],能够提供能量以及维持肠道菌群和电解质的稳定[13]。同时能影响血脑屏障通透性,维持中枢神经系统内环境稳定,被认为是微生物—肠—脑相互作用的关键递质,能够调控宿主认知功能等行为[14]。SCFAs减少则更容易发生认知障碍,进而出现神经退行性疾病[15]。

丁酸盐是厚壁菌门的主要产物[16],在大脑中可通过抑制组蛋白脱乙酰酶,对神经退行性疾病发挥神经保护作用并改善记忆[17]。帕金森病患者SCFAs浓度降低,尤其是丁酸盐浓度降低,肠道屏障渗透性和血脑屏障的通透性增加[18],脂多糖等促炎产物通过肠壁进入血液,穿过血脑屏障激活小胶质细胞并引发神经炎症反应,从而导致人和动物的认知能力下降[19]。研究[20]发现,厚壁菌门中毛螺菌科和梭菌科数量与认知表现呈正相关,在2型糖尿病患者中观察到其相对丰度降低。其中,梭菌的减少会增加肠道通透性,增加的渗透性使细菌或细菌成分如脂多糖和其他抗原渗入并引发炎症反应,从而影响大脑的认知能力[21]。本研究发现,WD认知功能障碍患者拟杆菌门增加,厚壁菌门、毛螺菌科、梭菌科、普氏菌科、普雷沃氏菌属、链球菌属、直肠真杆菌属降低,与相关研究结果一致。

综上所述,WD认知功能障碍的发病或整个病程中存在肠道菌群的参与,这些肠道菌群的改变可能通过SCFAs影响WD认知功能障碍。但其具体作用机制有待进一步研究。