灸预处理对乙醇诱导胃黏膜损伤大鼠TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白的影响

霍新慧,周知然,兰永利,韦 芳,阿斯卡尔·牙生

(1.新疆医科大学中医学院,新疆 乌鲁木齐 830001;2.新疆维吾尔自治区中医医院,新疆 乌鲁木齐 830001)

胃黏膜损伤的致病因素有很多,较为常见的是过度或长期饮酒导致的急性损伤。损伤过程中存在大量炎症细胞和炎症因子,一般而言,炎症反应是人体对抗损伤性刺激的一种自我防御,但是伴随着炎症反应的级联反应,机体无法继续维持稳态的正性调控状态时,则会导致疾病的发生发展[1]。

《黄帝内经》最早提出了“治未病”思想,孙思邈在《备急千金要方》中首次将灸法与“治未病”理论结合。艾灸作为“治未病”的有效手段,得到广泛应用。研究[4]表明,针灸防治慢性胃炎的机制主要是去除感染因素、调整胃肠激素、增强机体免疫、增加胃黏膜血流量、提高防御能力以及抑制腺体萎缩与增生。本课题组前期研究[5]证实,灸预处理可减轻大鼠急性胃黏膜损伤,增强胃黏膜微循环屏障,与针刺预处理比较,灸预处理的效果更佳[6]。

Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是炎症反应启动的重要环节[7]。髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)是TLRs受体信号转导途径中的关键接头分子。在TLR4信号通路中,核转录因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)处于枢纽位置,可激发胃黏膜相关炎症反应[8],影响胃黏膜损伤程度,介导炎症因子释放,如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)等[9]。

因此,本研究通过检测胃黏膜TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表达水平,探讨灸法预处理对胃黏膜的保护机制,从而为临床预防以胃黏膜损伤为病理基础的消化系统疾病提供理论基础。

1 材料

1.1 动物 30只清洁级SD大鼠,雌雄各半,6周龄,体质量(180±20)g,由新疆医科大学动物实验中心提供,动物生产许可证号: SCXK(新)2018-0003。饲养于新疆医科大学动物实验中心,温度 20～25 ℃,湿度 50%～54%,自然照明,自由摄食摄水,适应性饲养1周。本研究经过新疆医科大学动物伦理委员会审批,伦理审批号: IACUC-20230227-3。

1.2 药物与试剂 大鼠TNF-α ELISA试剂盒(批号202205)、大鼠IL-6 ELISA试剂盒(批号YX-E21122):上海优选生物科技有限公司;TLR4抗体(批号AF7017)、MyD88抗体(批号bs-1047R)、NF-κB p65抗体(批号 AF0874):江苏亲科生物;兔抗TLR4荧光抗体(批号YT0744)、兔抗MyD88荧光抗体(批号YT2928)、鼠抗NF-κB荧光抗体(批号Ym3111):美国Immunoway公司。

1.3 仪器 特制香烟型纯艾条(4 mm×120 mm):南阳卧龙汉医艾绒厂;非接触式红外额温计(型号IM-9001):江苏鱼跃医疗设备股份有限公司;光学显微镜(型号 BX51T-PHD-J11):日本奥林巴斯;多功能真彩色细胞图像分析管理系统(型号Image-Pro Plus):美国Media Cybernetics公司;酶标分析仪(型号Infinite F50):上海生物科技有限公司;蛋白印迹仪(型号Yrdimes SW07D0567)、凝胶成像分析系统(型号 KETA M):中国台湾威泰克有限公司。

2 方法

2.1 动物分组 将30只大鼠随机分为3组:正常组、模型组、灸预处理组,每组10只。实验过程严格遵守中华人民共和国科学技术部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

2.2 干预与模型复制

2.2.1 艾灸干预治疗 正常组和模型组大鼠常规饲养,正常抓取,固定于鼠板,不予干预,每次20 min,每日1次,连续7 d。灸预处理组于实验第1天起予以艾灸,每日均在上午10时开始进行艾灸治疗。取“足三里”(双)、“中脘”穴。操作:剃除大鼠穴位区域被毛,将大鼠仰卧位固定于鼠板,尽量保持自然状态,彩色笔标记穴位,采用特制香烟型纯艾条固定于悬灸支架上,使艾条点燃部位垂直距离大鼠穴位约2 cm,应用皮肤温度测定仪将灸处局部温度控制在42 ℃左右,治疗过程中注意处理艾灰,并不断调整艾条的固定长度,以保持穴区灸温,每次持续20 min,每日1次,连续7 d。第8天不予干预,自上午10时开始禁食不禁水。

2.2.2 模型复制 参照文献[10],结合前期经验[6],制备胃黏膜损伤模型。第9天开始(禁食不禁水24 h)进行模型复制:每日采用无水乙醇灌胃,剂量为每只大鼠6 mL/kg,然后灌胃阿司匹林混悬液200 mg/kg。每日22:00(即每次灌胃前12 h),模型组和灸预处理组禁食不禁水,连续灌胃4 d(第9天至第12天)。

2.2.3 组织取材 模型复制结束后,各组大鼠禁食24 h、禁水8 h,10%水合氯醛腹腔麻醉3 mL/kg,腹主动脉取血,后将胃取出,迅速用生理盐水冲洗,首先肉眼观察胃黏膜损伤情况,拍照并进行胃黏膜溃疡指数(ulcer index, UI)评估。将胃纵切为2份,每一份均含胃底、胃体和胃窦。其中一份胃组织用于苏木精—伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色和免疫组织化学检测;另一份胃组织刮取黏膜(置冰上进行),冻存管收集后立即置于液氮-80 ℃保存。

2.3 观察指标与方法

2.3.1 胃黏膜UI观察 将大鼠胃黏膜组织平展放置于预冷的滤纸上,参照文献[11]标准,采用卡尺对损伤部位进行测定。0分为正常,1分为斑点糜烂,2分为糜烂长度小于1 mm,3分为糜烂长度1～2 mm,4分为糜烂长度2～3 mm,5分为糜烂长度大于3 mm。当宽度大于1 mm 时各分值乘以2。UI值为各分值累计相加。

2.3.2 胃黏膜病理学观察 进行UI观察后,将含有胃底、胃体和胃窦部分的大鼠胃组织固定后常规石蜡包埋并切片,显微镜下观察胃黏膜病理变化。

2.3.3 大鼠血清TNF-α、IL-6水平 取腹主动脉血自然凝固10～15 min,3 000 r/min离心20 min后收集上清液。严格按照ELISA试剂盒的说明书进行操作,检测大鼠血清TNF-α、IL-6水平。

2.3.4 免疫组织化学法检测胃黏膜组织TLR4、MyD88、NF-κB p65表达水平 严格按照试剂盒方法进行操作,将常规石蜡包埋和组织切片经抗原修复后,用正常羊血清液封闭20 min,将配置好的TLR4工作液(1∶50稀释),以及MyD88、NF-κB p65一抗工作液(1∶100稀释)滴在组织上,4 ℃过夜,PBS洗涤后滴加生物素化二抗、辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液,DAB显色、复染、封片后,拍照并进行图像分析。

2.3.5 Western blot法检测胃黏膜组织TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白表达水平 分别称取大鼠胃黏膜组织100 mg,剪碎组织后置于裂解液中,匀浆后12 000 r/min离心20 min,提取总蛋白。分别经制胶、上样、电泳、转膜和封闭操作后,加入稀释的TLR4、MyD88和NF-κB (1∶1 000) 一抗,4 ℃孵育、洗膜,二抗(1∶8 000)37 ℃孵育、洗膜,使用凝胶成像仪成像。采用Gel-Pro Analyzer 4软件对结果进行灰度分析。

2.4 统计学方法 采用SPSS 22.0进行统计分析。采用GraPhad Prism 7.0软件进行图表绘制。计量资料比较用单因素方差分析,先进行方差齐性检验,方差齐用LSD法分析,方差不齐用Dunnett’sT3法。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 灸预处理对乙醇诱导的胃黏膜损伤大鼠胃黏膜UI的影响 正常组大鼠胃黏膜光滑完整;模型组大鼠胃黏膜可见斑点状出血灶,UI显著高于正常组(P<0.05);灸预处理组大鼠胃黏膜仅见少量斑点状出血,UI显著低于模型组(P<0.05)。见图1。

注:A.正常组;B.模型组;C.灸预处理组;与正常组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05

3.2 灸预处理对乙醇诱导的胃黏膜损伤大鼠胃黏膜组织形态的影响 正常组大鼠胃黏膜各层结构完整、清晰,未见破损,细胞排列紧密、整齐有序,未见脱落及萎缩、水肿及炎症细胞浸润等病理现象。模型组大鼠胃黏膜上皮结构破坏严重,可见腺体中断,部分可见红细胞渗出,腺体扩张,有红细胞外渗形成出血灶,炎症细胞浸润。灸预处理组大鼠胃黏膜损伤情况较轻,结构较清晰,有轻微的上皮细胞脱落,有少量炎性渗出物,可见新生的肉芽组织和毛细血管。见图2。

注:A.正常组;B.模型组;C.灸预处理组

3.3 灸预处理对乙醇诱导的胃黏膜损伤大鼠血清TNF-α、IL-6水平的影响 与正常组比较,模型组大鼠血清TNF-α、IL-6水平显著升高(P<0.05)。与模型组比较,灸预处理组大鼠血清TNF-α、IL-6水平显著降低(P<0.05)。见图3。

注:A.正常组;B.模型组;C.灸预处理组;与正常组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05

3.4 免疫组织化学法检测灸预处理对乙醇诱导的胃黏膜损伤大鼠胃黏膜TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表达水平的影响 与正常组比较,模型组大鼠胃黏膜TLR4、MyD88、NF-κB p65表达水平均显著升高(P<0.05)。与模型组比较,灸预处理组TLR4、MyD88、NF-κB p65表达水平均显著降低(P<0.05)。见图4。

3.5 Western blot 法检测灸预处理对乙醇诱导的胃黏膜损伤大鼠胃黏膜TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表达水平的影响 与正常组比较,模型组大鼠胃黏膜TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)。与模型组比较,灸预处理组TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。见图5。

注:A.正常组;B.模型组;C.灸预处理组;与正常组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05

4 讨论

正常情况下,人体胃黏膜能够抵御物理因素、化学因素以及细菌或毒素等致病因素,当致病因素超出胃黏膜保护的程度,或当胃黏膜自我防御能力不足时,就会引起胃黏膜损伤[12]。胃黏膜损伤的病理状态,在常见的消化道疾病中均可出现,进行未病先防减轻胃黏膜损伤程度,进而缓解消化系统疾病的发展,在临床中有重要意义。

中医认为,脾胃为“后天之本”“气血生化之源”,脾气健则气血足,抵御各种病邪,即阴平阳秘则安和[13]。灸法操作简便,在“治未病”方面具有优势。艾灸“养胃”主要体现为调补温通的作用,艾灸通过温热刺激腧穴,调动经络之气,从而激发机体自身的调节防御能力,在疾病尚未发生时就进行艾灸,可激发一身经气,扶助正气,以防止疾病的发生[14]。本课题组前期研究[5-6]证实,针灸预处理对胃黏膜具有一定的保护作用。

“足三里”作为足阳明经的合穴兼胃腑的下合穴,是主治胃病的首选穴[15],也是历代医家防病保健、扶助正气的必用穴位。中脘作为胃的募穴,善治胃腑病,是防治消化系统疾病的重要腧穴。中脘与足三里“合募配穴”,调理脾胃,补中益气,相辅相成。

无水乙醇是高刺激性化学类攻击因子,当其被摄入过量、超出胃黏膜屏障保护的范围时,则可能产生影响胃黏膜屏障微循环、激发炎症因子、诱导细胞凋亡等病理变化[16]。乙醇损伤大鼠胃黏膜与人类胃黏膜损伤基本相似,故将其作为研究胃黏膜损伤的经典动物模型[17]。

TNF-α、IL-6是常见的炎症因子,通常用于评价胃黏膜的损伤程度[18]。TLR4/MyD88/NF-κB信号通路能够启动一系列相关的炎症信号的级联反应,引起多种炎症因子的释放,如TNF-α和IL-6,在介导炎症反应中发挥着重要作用[19]。

本研究显示,与正常组比较,模型组和灸预处理组大鼠血清TNF-α、IL-6水平均显著升高,与模型组比较,灸预处理组大鼠血清TNF-α、IL-6水平均显著降低。模型组TLR4、MyD88、NF-κB p65表达水平显著升高,而灸预处理组TLR4、MyD88、NF-κB p65表达水平均低于模型组,提示艾灸通过调控TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表达水平,增强胃黏膜自我防御能力,通过调控炎症因子的释放对抗炎症反应,以减轻大鼠胃黏膜的损伤。

综上所述,灸预处理可减轻胃黏膜损伤程度,防止消化系统疾病的发生发展,灸法可通过多个方面激发胃黏膜的保护作用,其作用机制需进一步研究。