miRNA-494-3p 靶基因预测及其相关信号通路的生物信息分析

王玉美 徐广峰 张琳欣 郑 君 杨 欣 张佩滢 林小飞

微小RNA（microRNA, miRNA）是在真核生物中发现的一类内源性具有调控功能的非编码RNA，在物种进化中相当保守，其通过与靶标mRNA 3'UTR区结合，以抑制翻译或降解靶标mRNA，实现对基因表达的负调控作用。越来越多的研究已证实miRNA 的功能强大，它不但参与了多种生命活动，包括细胞内信号转导、细胞增殖、分化、凋亡、代谢、心脏发育、脑发育等，而且在多数疾病的发生发展过程中也发挥着重要作用[1-9]。本课题组在前期研究中，采用μParaflo®微流体芯片技术检测人脂肪组织miRNA 表达谱差异时，筛选出一条高表达于正常人脂肪组织、低表达于肥胖伴胰岛素抵抗患者脂肪组织中的miR-494-3p。为进一步开展miR-494-3p 的靶基因鉴定和功能研究，本文采用生物信息学的方法对miR-494-3p 进行靶基因预测，并对预测的靶基因集合进行基因本体（geneontology, GO）和生物学通路的富集分析。

1 材料与方法

1.1 靶基因预测

应用miRNA 靶标基因数据库StarBase（https://starbase.sysu.edu.cn/）进行靶基因预测，得到有关miRNA-494-3p 的靶基因总数。此靶基因数据库集成了microT、miRanda、miRmap、PITA、RNA22、PicTar和TargetScan 共7 个传统常用的miRNA 靶标预测工具。选取miRanda、PITA 和Targetscan 3 个数据库预测结果的交集作为进一步分析的基因集合。

1.2 GO 分析

利用DAVID 数据库（https://david.ncifcrf.gov/），应用GO 对靶基因进行功能富集分析，根据GO 注释中的分子功能、生物学过程、细胞组分等应用选项，进行相应GO 注释显著性分析（P＜0.05）。

1.3 京都基因与基因组百科全书（KEGG）信号通路富集分析

应用DAVID 数据库（https://david.ncifcrf.gov/），针对预测出的相关靶基因，进行KEGG 信号转导通路富集分析，通过软件附带的Fisher Exact Test 计算P值，P＜0.05 代表具有统计学意义的信号转导通路。

1.4 统计学分析

采用SPSS 26.0 统计软件进行数据分析，GO分析及KEGG 信号通路富集分析中数据间差异比较采用ANOVA 检验，其中KEGG 中数据P 值采用Fisher's exact test 计算，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 靶基因预测结果

采用 miRNA 靶标基因数据库 StarBase 中miRanda、PITA 和Targetscan 3 个数据库对miRNA-494-3p 的靶基因进行预测，结果发现预测靶基因共有253 个。部分靶基因见表1。

表1 miRNA-494-3p经由StarBase预测所得的部分靶基因

2.2 GO 分析结果

利用DAVID 数据库，对以上miRNA-494-3p 的253 个靶基因进行GO 功能富集分析，共得到24 条靶基因的分子功能注释信息、47 条靶基因的生物学过程注释信息及23 条靶基因的细胞组分注释信息。随后将以上基因分别投射至GO 的三大应用功能上，结果显示，miRNA-494-3p 预测靶基因集合分别富集在蛋白质结合、双链DNA 结合、RNA 结合等分子功能，RNA 聚合酶Ⅱ的转录调控、细胞增殖的正调控、细胞分化、细胞凋亡等生物学过程以及细胞核、核质、胞浆、细胞质、细胞隔膜等细胞组分上。见表2～4。

表2 miRNA-494-3p 预测靶基因GO 分析的分子功能分类（P＜0.01 列举如下）

表3 miRNA-494-3p 预测靶基因GO 分析的生物学过程分类（P＜0.01 列举如下）

表4 miRNA-494-3p 预测靶基因GO 分析的细胞组分分类（P＜0.01 列举如下）

2.3 KEGG 信号通路富集分析结果

应用DAVID 数据库，在GO 注释分类的基础上，针对预测出的253 个靶基因集合，进行KEGG 信号转导通路富集分析。结果显示，miRNA-494-3p 的靶基因功能主要富集于癌症通路、FoxO 信号通路、细胞吞噬作用、刺猬信号通路、细胞黏附连接、肌动蛋白细胞骨架的调控、谷氨酸能突触、昼夜节律以及p53 信号通路中（P＜0.05）。见图1。

图1 miRNA-494-3p 预测靶基因的KEGG 信号通路气泡图

3 讨论

自从1993 年首次发现miRNA 以来，人们一直在积极研究miRNA 在病理和生理条件下的关键作用[10]。近年来，越来越多的研究证实，miRNA 功能涉及多种生物学过程，如细胞增殖、分化、代谢、胚胎发育、炎症、衰老和程序性细胞死亡等[11-15]，miRNA的异常表达会导致多种人类疾病发生[16-20]。随着miRNA 研究的日益深入，人们发现的miRNA 种类越来越多，每个miRNA 可能有多个靶基因，而几个miRNA 也可以调节同一个基因。面对数目巨大的miRNA，如何开展其功能研究成为严峻挑战。GO 分析及KEGG 信号通路富集分析等生物信息学分析方法的出现为miRNA 表达谱之后的相关研究（如靶基因的验证、miRNA 的具体调控机制等）提供了有力证据。

本研究应用miRNA 靶标基因数据库StarBase 进行靶基因预测，选取miRanda、PITA 和Targetscan 3个数据库预测结果的交集（共253 个靶基因）作为进一步分析的基因集合。然后利用DAVID 数据库，对253 个靶基因进行GO 分析和KEGG 信号通路富集分析，结果显示，miRNA-494-3p 功能主要富集在蛋白质结合、双链DNA 结合、RNA 结合等分子功能，RNA 聚合酶Ⅱ的转录调控、细胞增殖的正调控、细胞分化、细胞凋亡等生物学过程以及细胞核、核质、胞浆、细胞质、细胞隔膜等细胞组分上。miRNA-494-3p参与的生物学通路主要富集于癌症通路、FoxO 信号通路、细胞吞噬作用、刺猬信号通路、细胞黏附连接、肌动蛋白细胞骨架的调控、谷氨酸能突触、昼夜节律以及p53 信号通路中。国内外多项研究表明，miRNA-494-3p 参与多个生物学过程[21-22]及多种疾病的发生发展进程，主要包括癌症[23-25]、心血管疾病[26-28]、肺部疾病[29]、脑损伤[30]、免疫系统功能改变[31]以及胰岛素抵抗、2 型糖尿病[32]等，与本文对miRNA-494-3p 生物信息学分析的结论相吻合。Peng 等[21]的研究发现，在周围神经损伤的Sprague-Dawley 大鼠中，miR-494-3p 表达水平降低，但Krüppel 样因子7（KLF7）表达水平提升。敲除miR-494-3p 可促进细胞增殖，并抑制细胞凋亡，而过表达miR-494-3p 或沉默KLF7 则会导致相反的结果。实验证实，miR-494-3p 通过负性调节KLF7 介导神经膜细胞的增殖和凋亡。一项有关鼻咽癌的研究[24]显示，与非肿瘤鼻咽上皮组织或鼻咽细胞（NP69）相比，miR-494-3p 在鼻咽癌标本和鼻咽癌细胞系中普遍上调。进一步机制研究证实，miR-494-3p 通过与靶基因Sox7 非翻译区的特定位点结合，在转录后水平对Sox7 进行负调控，促进鼻咽癌细胞的生长、迁移和侵袭。Zheng 等[27]的研究证实，BRD4 是miR-494-3p 的靶基因，通过上调miR-494-3p和抑制 BRD4，可以抑制组蛋白去乙酰化酶 3（HDAC3）的表达水平，在心肌缺血再灌注损伤（MI/RI）中发挥保护作用，这可能有助于MI/RI 的治疗。吴洁等[32]对体外高糖高脂诱导的H9c2 细胞胰岛素抵抗模型进行研究，结果发现miR-494-3p 通过下调胰岛素受体底物-1（IRS1）促进糖尿病大鼠心肌细胞胰岛素抵抗的形成。

综上所述，miRNA-494-3p 的功能主要富集在与癌症、胰岛素抵抗、糖尿病、炎症、胚胎发育等相关的多个信号通路中，为进一步研究其对靶基因和信号通路的调控作用及其可能的机制提供了线索。