基于网络药理学与分子对接分析都梁丸抗偏头痛的作用机制

王 静 朱春璐 袁子民*

都梁丸收载于2020 版《中华人民共和国药典》一部[1]，由白芷（酒炖）和川芎组成，具有祛风散寒、活血通络功效，临床用于风寒瘀血阻滞脉络所致的头痛，但其作用机制尚未完全阐明。本研究结合前期研究确定的都梁丸入血成分，利用网络药理学与分子对接技术，通过基因本体（GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路注释分析等生物学信息手段对靶点及通路进行分析，深入研究都梁丸的效应物质、质量标志物（Q-Marker），探讨都梁丸抗偏头痛的作用机制，为都梁丸的临床应用、药效物质基础与作用机制的深入研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要数据库和软件

主要数据库和软件见表1。

表1 主要数据库和软件

1.2 化合物信息

本研究前期血清药物化学研究结果表明，都梁丸中有12 种活性成分入血，可能为其主要的药效物质基础，即花椒毒酚、水合氧化前胡素、白当归素、氧化前胡素、白当归脑、佛手柑内酯、欧前胡素、异欧前胡素、阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯A、藁本内酯，其中白芷有8 个，川芎有4 个[2]。通过TCMSP 数据库检索12 个化合物的结构、成分编号（MOL.ID）、分子式信息。见表2。

表2 都梁丸入血的化学成分

1.3 化合物潜在靶点的反向预测

采用ChemBioDraw Ultra 14.0 中Structure 选项下的“Covert Name to Structure”的功能绘制出12 个化合物的2D 结构，并以MDL SDfile（*.sdf）格式保存。再打开Chem3D 软件，将12 个化合物的2D结构转换为3D 结构，并以SYBYL2（*.mol2）格式保存后，上传到PharmMapper Serve 服务器进行靶标反向预测，以活性小分子为探针，搜寻潜在靶点，预测其生物活性。结果按Fit score 由高到低排序，选取每个化合物的前25 个靶标作为备选靶标。

1.4 潜在靶点的筛选

在DrugBank数据库检索美国食品药品监督管理局（FDA）批准“antimigraine”的小分子药物。在GeneCards 和NCBI 数据库检索与偏头痛相关的疾病靶点。对获得的备选靶标与疾病靶点进行对比分析，归纳总结抗偏头痛作用的潜在靶点。

1.5 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的构建

将22 个潜在靶点导入String 数据库中，对象限定为人，设定combine score＞0.7，获取PPI 信息。将获得的PPI 信息导入Cytoscape 3.6.0 软件中绘制PPI 网络图。

1.6 基因本体（GO）富集分析和KEGG 通路注释分析

用Rv 3.5.1 软件对潜在靶点进行GO 富集分析和KEGG 通路注释分析。GO 富集分析包括生物过程、分子功能和细胞组分3 个分支，并运用GrapHPad Prism 软件绘制出3 个模块的条形图。

1.7 活性成分-潜在靶点-通路网络图的构建

将活性成分、潜在靶点和通路导入Cytoscape 3.6.0软件中，构建活性成分-潜在靶点-通路的网络图。

1.8 分子对接验证

选取PPI Degree 排名前8 的靶点与都梁丸中的12 个活性成分进行分子对接验证，用ChemBioDraw Ultra 软件绘制活性成分的3D 图，利用PharmMapper数据库得到靶点的蛋白质结构数据库编号（PDB ID）后，用Systems dock Web Site 进行分子对接[3]。

2 结果

2.1 潜在靶点预测

采用PharmMapper 数据库得到备选靶标，将备选靶标与DrugBank、GeneCards、NCBI 数据库检索的疾病靶点对比分析，归纳总结22 个靶点作为抗偏头痛的潜在靶点，具体结果见表3。都梁丸中12 个活性成分对应的潜在靶点数见表4，都梁丸中潜在靶点数量排名前5 的活性成分有3 个是白芷的成分，2 个是川芎的成分。

表3 活性成分潜在靶点信息

表4 都梁丸中活性成分靶点数目

2.2 潜在靶点PPI 网络构建与分析

将上述20 个潜在靶点（MAPK10、BRAF 与其他蛋白没有相互作用）相互作用网络图信息导入Cytoscape 软件中，共有20 个节点、38 条边。节点表示蛋白，边表示蛋白相互作用。在Cytoscape 的generate style from statistics 工具中获得度值和靶点。见表5。

表5 都梁丸相互作用蛋白重要靶点及度值

2.3 GO 富集分析及KEGG 通路注释分析

从都梁丸中预测出的22 个潜在靶点导入Rv 3.5.1软件中进行GO 富集分析和KEGG 通路注释分析。得到影响显著的通路（P＜0.05）有46 条，与抗偏头痛作用相关的主要通路有3 条：hsa04614（Reninangiotensin system）、hsa04010（MAPK signaling pathway）、hsa04931（Insulin resistance）。GO 富集分析结果显示，在生物过程中这些靶点主要涉及激素代谢过程、对类固醇激素的反应、腺体发育过程；在分子功能中主要涉及激素结合、类固醇结合、内肽酶活性等方面；在细胞组分中主要涉及质膜外侧、膜筏、膜微区、膜区、细胞质囊泡腔、囊泡腔、受体复合物等方面。

2.4 活性成分-潜在靶点-通路网络模型构建

构建“成分-潜在靶点-通路”的模型中有80 个节点和190 条边，浅灰色代表预测靶点，灰色代表活性成分，深灰色代表通路，边表示三者之间的相互作用，结果如图1。都梁丸中有12 个活性成分作用于不同靶点，靶点分布于不同通路，相互协调、共同调节都梁丸抗偏头痛的作用，符合中药复方“多成分-多靶点-多途径”的作用特点。

图1 都梁丸活性成分-靶点-通路网络

2.5 分子对接

对PPI 网络中Degree 排名前8 的重要靶点（表5）进行分子对接验证，用GrapHPad Prism 绘制分子对接结果热图，docking score 在4.25～5 为深灰色，docking score 在5～7 为白色，docking score＞7 为黑色，结果见图2。以对接得分最大的佛手柑内酯为例，将其与靶标（AR、ESR1）进行分子对接，结果见图3～4。一般认为docking score＞4.25 具有生物活性，本研究对接结果中docking score＞4.25 占76%，表明12 个活性成分与8 个重要靶点有较好的结合活性。

图2 12 个活性成分对接得分结果热图

图3 与AR 靶标分子对接

图4 与ESR1 靶标分子对接

3 讨论

都梁丸中白芷为君药，体现了白芷在都梁丸中的重要性；川芎为臣药，其配伍原理是引药上行，上达头目。根据传统中医药理论，都梁丸的多成分多靶点的作用机制，符合中药复方的特点。本研究通过前期血清药物化学研究结果确定了都梁丸中可能潜在的药效物质基础的活性成分，本研究采用网络药理学和分子对接技术发现都梁丸的活性成分主要通过调控MME、肾素-血管紧张素系统、激素受体途径发挥抗偏头痛作用。在活性成分与潜在靶点的PPI 研究中，经网络分析后发现血管紧张素转换酶（ACE）、ESR1、AR、SHBG、MME 等主要靶点可能与偏头痛发生密切相关。ACE 是RAS 中的关键酶，可使血管紧张素Ⅰ转化为血管紧张素Ⅱ，血管紧张素转化酶抑制剂（ACEI）类药物在预防偏头痛中起着重要作用。ACEI 是一种缓激肽的抑制剂，缓激肽可以产生P 物质（SP），SP 是中枢神经系统的致痛物质[4-6]；SP 和降钙素基因相关肽（CGRP）共同调节三叉神经纤维的敏感性，而三叉神经的活化可导致神经肽的释放，CGRP 可增强SP 的作用，原因为CGRP 可抑制SP 降解酶活性，文献[4,7]报道SP与CGRP 间存在微弱的相关性，发作期间偏头痛组SP、CGRP 水平明显高于对照组，ACE 活性与SP 水平成正比，ACE 活性与CGRP 水平之间未发现相关性。RAS 系统可以干扰一氧化氮（NO）的生物利用度并促进氧化应激，NO 产生增加，血管紧张素Ⅱ通过血管紧张素Ⅱ受体激活NF-κB 中的神经激肽，使一氧化氮合酶（NOS）的表达增加[6,8]。偏头痛发作时血浆中的NO 水平升高，NOS 参与内源性NO 的合成，所以NOS 水平也升高。本研究发现都梁丸可能作用于ACE 进一步降低CGRP、SP、NO 水平，抑制NOS 活性，进一步降低神经源性炎症反应发挥抗偏头痛作用[9]。

现代研究表明偏头痛发病与性激素受体途径存在一定关系，目前有8 个基因被研究，即：ESR1、ESR2、PGR、AR、FSHR、NRIP1、CYP19A1、MTHFR[10]。CYP19A1 是雌激素产生的关键酶，CYP19A1 基因遗传变异与循环激素水平有关，循环激素水平可能取决于性激素结合球蛋白（SHBG）水平[11]。有研究表明，在美国和西欧终生患有偏头痛的女性约为43%，男性约为18%。女性患有月经性偏头痛或月经相关性偏头痛与雌激素水平存在一定关系[12-13]，近年来雌激素代替治疗可缓解偏头痛得到广泛的认可，有研究证实雌激素水平与偏头痛发生负相关，雌激素水平升高可减少发病次数[14]。雌激素受体基因的遗传变异也是导致偏头痛发病的重要环节，有研究表明编码性激素受体途径中蛋白质的基因变异与偏头痛之间存在一定关系[13]。本研究发现都梁丸可能具有调节激素受体作用，改变激素水平，可为都梁丸用于激素引起的偏头痛的治疗提供科学依据。

MME 基因又称脑啡肽酶（NEP）基因，主要影响β-淀粉样蛋白（Aβ）代谢通路，是一种切割大量底物的金属肽酶及参与脑内Aβ 降解代谢的限速酶，在阿尔茨海默病（AD）发病机制中起保护作用[15]。其表达下调可加剧Aβ 聚集，上调其表达能降低脑内Aβ 水平。Aβ 可不可逆抑制毛细血管内皮细胞Na+-K+-ATP 酶活性，导致脑脊液中Na+浓度降低，从缓解偏头痛的发生[16]。都梁丸可能通过抑制NEP 酶活性，减缓Aβ 聚集，抑制毛细血管内皮细胞Na+-K+-ATP酶的过度活跃，阻止皮质扩散性抑制（CSD）发生，从而预防偏头痛发作[17-18]。

GO 富集分析结果表明潜在靶点在激素结合、类固醇结合、内肽酶活性功能参与最多，在脂膜外侧、膜筏、膜微区、膜区、细胞质囊泡腔、囊泡腔、受体复合物分布最广，并主要参与激素代谢过程、对类固醇激素反应等生物过程。

在KEGG 通路分析中发现，都梁丸可能通过胰岛素抵抗、MAPK 信号通路、调节肾素-血管紧张素系统等发挥抗偏头痛作用。现代研究表明慢性偏头痛发生与胰岛素抵抗具有相关性，主要与下丘脑神经肽Y（NPY）分泌增加引起胰岛素敏感性受损，出现胰岛素抵抗有关[19]。MAPK 活化主要通过逐级磷酸化发挥信号传导的生物功能，信号通路ERK1/2和P38 以磷酸化形式被激活，通过调控靶蛋白转导来参与炎症和疼痛等反应。神经源性炎症期间释放炎症因子可激活MAPK 信号转导级联途径，引起偏头痛发作[20]。另外有研究表明白芷-川芎药对中的活性成分主要通过调节5-羟色胺（5-HT）和能量代谢通路治疗偏头痛[21]。但本研究的KEGG 通路分析结果与其不同，可能与活性成分的选择、数据库及使用软件等不同有关。

分子对接结果分析，docking score＞7 表明蛋白与化合物有强烈的结合性，本研究发现花椒毒酚与AR、ESR1 的docking score 分别为7.983、7.971，佛手柑内酯与AR、ESR1 的docking score 分别为8.059、8.137，说明激素受体在治疗偏头痛方面有重要的作用，但有关ESR1 报道较多，AR 较少，可进一步深入研究AR 在抗偏头痛中的作用机制。本研究发现docking score＞7 的成分主要来源于白芷，未有川芎中的成分，两者均为入血成分，可能是治疗偏头痛主要的药效物质基础，体现了都梁丸中以白芷辛温发散、祛寒止痛为君药，川芎活血行气、引药上行为臣药的配伍理论。