HS-SPME结合GC-MS法测定松露中的挥发性成分研究

黄文芊,李雨龙,李 勇,侯 英*

（1.云南曾味食品有限公司，云南 昆明 650000；2.西南林业大学，云南 昆明 650000;3.云南华衡检测技术有限公司，云南 昆明 650000）

松露是松露属（Tuber）产量在商业贸易中的统称，隶属于子囊菌门（Ascomycota）、盘菌纲（Pezizomycetes）、盘菌目（Pezizales）、松露科（Tuberaceae），子实体生于地下，俗称猪拱菌、黑菌和块菇［1］。常与壳斗科、松科、桦木科、杨柳科等植物形成地下共生关系，其生长依赖于植物提供的有机物，同时能促进宿主植物根系土壤养分、水分的吸收，在生态系统中具有重要功能［2-3］。目前世界上发现的松露种类近100 种，其中法国的黑松露（Tuber Melanosporum）、意大利的白松露（Tuber Magnatum）以及中国的印度松露（Tuber Indicum）和中华夏松露（Tuber Aestivum）都极具商业价值，受到众多食客的追捧。松露被冠以“餐桌上的黑钻石”之称，其独特馥郁的香气除受到众多食客的追捧，更是吸引相关学者们对其开展各方面研究［4-6］。目前为止，从松露中已鉴定出约200多种香气成分［7-8］，相关研究主要考察的是不同品种、地区对香气成分的影响［9-12］。由于云南产松露种类繁多，其受云南特殊低纬高海拔及立体气候等多因素的影响，云南产的松露种间差异较大。云南成熟松露采收通常在每年的11月至次年3月，但受利益驱使，通常每年7月就会上市大量不成熟的子实体，不但产品质量和价值不高，且造成松露年产量逐渐下降。因此，亟待开发较为灵敏的测定方法对不同采收期松露的有效成分进行识别，并为松露的资源保护提供基础依据［13］。

松露中香气成分的传统提取方法有液-液萃取法、蒸馏法、静态顶空法、动态顶空法等。自20世纪90年代以来，固相微萃取（SPME）以其样品用量少、操作简单、快速且最大程度避免非挥发性组分污染的优势成为众多学者研究微量挥发性成分的首选样品处理方法［14-20］。试验采用顶空-固相微萃取（HS-SPME）结合气相色谱-质谱联用法（GC-MS）对云南不同区域产地的印度松露香气成分进行检测，同时对比不同印度松露的香气成分特征，旨在了解不同产地印度松露中香气成分的差异，为印度松露品质判断和松露香料产品开发提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

印度松露：采集云南不同产地的7个印度松露，每个样品用锡箔纸包好后，存放于冷藏箱中，带回实验室后，立即于－18℃冰柜中冷冻保存，备用。样品信息见表1。

表1 印度松露样品信息

仪器与设备：7890B-5975B 气相-质谱联用仪（GC-MS），美国安捷伦（Agilent）科技有限公司；HP-5MS 毛细管柱，30 m×0.25 mm×0.25 μm，美国安捷伦（Agilent）科技有限公司；AB-204 电子分析天平，美国梅特勒（Mettler）公司；固相微萃取手柄，美国Supelco 公司；75 μm Carboxen- PDMS 固相萃取头（黑头）、85 μm PDMS/DVB 固相萃取头（白头）、100 μm PDMS 固相萃取头（红头）、65 μm PDMS/DVB 固相萃取头（蓝头）和30 μm PDMS/DVB 固相萃取头（黄头），美国Supelco 公司；22 mL 顶空瓶，美国安捷伦（Agilent）科技有限公司；LIDA 加热搅拌台，广东科力达仪器有限公司；萘，99%，美国百灵威科技有限公司；乙醇，色谱纯，美国迪马公司。

1.2 方法

1.2.1 GC/MS 条件 气相色谱条件：进样口温度为250 ℃，载气为He，流速为1 mL/min，升温程序为40 ℃保持1 min，以2 ℃/min 升温至100 ℃，保持3 min，再以5 ℃/min 升温至200 ℃，保持2 min。

质谱条件：接口温度为230 ℃；四极杆温度为150 ℃；离子源：EI 源，电子能量70 eV，质量扫描范围40～350 amu。

1.2.2 数据检索和计算 采集的质谱数据经NIST 15 标准谱库进行检索和鉴定，以萘为内标，计算松露样品中挥发性成分的相对含量。

1.2.3 检测方法 试验开始前，将萃取头插入GC 进样口于300 ℃老化1 h，直至无杂峰出现。

配制萘溶液（内标）：取0.100 g 萘，用乙醇配制成浓度为100 μg/ mL 的内标溶液。将松露在室温下解冻，切成约2 mm×2 mm的碎片。准确称取制备好的样品0.2 g 置于22 mL 顶空瓶中，同时在顶空瓶中加入1 μL浓度为100 μg/mL 的萘溶液作为内标，及时封好瓶盖后，将顶空瓶放置于加热搅拌台上加热，将固相萃取手柄插入顶空瓶内并伸出萃取头后进行顶空萃取。

萃取条件的优化包括：1）固定萃取温度70 ℃，萃取时间70 min，解吸温度250 ℃，解吸时间3 min，优化萃取头种类（白头、黑头、红头、黄头和蓝头）；2）固定萃取头黑头，萃取时间70 min，解吸温度250 ℃，解吸时间3 min，优化萃取温度（50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃和90 ℃）；3）固定萃取头黑头，萃取温度70 ℃，解吸温度250 ℃，解吸时间3 min，优化萃取时间（50 min、60 min、70 min 和80 min）；4）固定萃取头黑头，萃取温度70 ℃，萃取时间50 min，解吸时间3 min，优化解吸温度（240 ℃、250 ℃、260 ℃和270 ℃）；5）固定萃取头黑头，萃取温度70 ℃，萃取时间50 min，解吸温度250 ℃，优化解吸时间（1.0 min、2.0 min、3.0 min和4.0 min）。萃取完成后，将萃取头插入GC 进样口上进行解吸附，挥发性成分进入气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）在1.2.1 所述条件下进行分离与鉴定，采用NIST 15 标准谱库进行检索，以萘内标作为参考，对挥发性化合物进行相对定量，以出峰数目和峰面积总量作为试验条件优化的依据。

1.2.4 精密度检测 为考察测定该方法的精密度，进行6 次平行测定，并计算各成分6次测定的相对标准偏差（RSD）。

1.2.5 松露香气成分测定 采用试验所得的最优萃取条件对来自不同产地的7 个印度松露样品进行挥发性成分分析测定。

2 结果与分析

2.1 松露的SPME优化结果

从图1可知，松露样品中的挥发性成分均在50 min 内完成出峰。出峰数为67 个，含量较高的物质为己醛、乙酸、1-辛烯-3-醇等。

图1 样品的总离子流量图（TIC）

2.2 最佳萃取条件

2.2.1 萃取头 由图2 可知，黑色萃取头吸附松露的总峰数量为68 个，同时总峰面积达83.52%，为所有萃取头中最优，因此选择黑色的萃取头作为测定松露挥发性成分的萃取头。

图2 不同萃取头对松露挥发性成分的萃取效果

2.2.3 萃取时间 由图4 可知，在30～50 min，总峰面积变化不明显。总出峰数随萃取时间增加而略有增加，在50 min 时总峰面积及总峰数均达到最高值，分别为77.65%与68 个。进一步增加萃取时间到60 min，总峰面积和总峰数均下降，因此选择50 min 作为萃取松露挥发性成分的最佳时间。

图4 不同萃取时间对松露挥发性成分的萃取效果

2.2.2 萃取温度 由图3 可知，在一定温度范围内松露挥发性成分总量随温度的升高而升高。当温度为70 ℃时，挥发性成分的总峰面积最高，达74.7%。同时，总峰数量也达67 个。但随着温度升高到80 ℃，总峰面积和总峰数均开始下降。综上，选择70 ℃为萃取松露挥发性成分的最佳温度。

图3 不同萃取温度对松露挥发性成分的萃取效果

2.2.4 解吸温度 从图5 可知，在不同解吸温度下松露挥发性成分总峰面积的总量分别为81.61%、82.37%、77.82%和80.94%。但根据总峰数情况来看，随解吸温度的升高，总峰数先升高，250 ℃时解吸得到物质总量最多，为49个。但进一步升温，总峰数开始迅速减少。综合总峰面积和总峰数的情况，最佳解吸温度为250 ℃。

图5 不同解吸温度对松露挥发性成分的萃取效果

2.2.5 解吸时间 从图6 可知，解吸时间为4 min 时挥发性成分的总峰面积达到最大，为82.18%，但总峰数仅35 个，明显少于2 min解吸时间下的总峰数（40 个）。解吸时间为2 min时总峰面积（76.35%）虽略低于解吸时间为4 min 时的挥发性成分总峰面积，但总峰数比解吸时间为4 min 时多，即萃取的有效松露挥发种类更多，对萃取松露的特征挥发性香气更为有利，因此，综合选择2 min 作为萃取松露挥发性成分的最佳解吸时间。

图6 不同解吸时间对松露挥发性成分的萃取效果

2.3 测定方法的精密度

6 次测定的各挥发性组分的RSD值为2.58%～26.83%，其中萘（内标）的RSD值为11.48%，大部分挥发性成分的RSD值均小于20%，方法的精密度可满足松露中挥发性成分的测定。

2.4 松露的香气成分测定

试验通过样品挥发性成分化学性质的初步分类，可对云南省松露样品香气的复杂程度及香气浓郁度进行初步判定。由表2可知，不同产地来源的印度松露的主要挥发性成分有醇类、酯类、醛类和酮类等物质，其中含量较多的是酯类和醛类，平均占比为31.89%和23.90%，而酮类物质含量最少，为8.34%。

表2 不同产地印度松露的挥发性成分个数及其总量

各地印度松露的挥发性成分种类最多的是4#和5#，共鉴定出挥发性成分91 个，7#样品中的挥发性成分个数最少，仅60 个。由此可推测，4#和5#的香气丰富度比测定的其他松露样品更高。不同产地印度松露的挥发性成分总量最多的是4#样品，其挥发性成分总量为83.6%，香气浓郁度最高。6#样品鉴定出的成分总量最少，为66.7%。

3 结论

试验采用顶空固相微萃取并结合气相色谱-质谱联用技术测定松露中的挥发性成分，采用单因素对固相微萃取条件进行优化，得到的萃取优化条件为采用黑萃取头在萃取温度为70 ℃，萃取时间为50 min 的条件下，将萃取完成后的萃取头立即插入GC-MS 进样口进行解吸，解吸温度为250 ℃，解吸时间2 min。同时，对方法的精密度进行了评价，6 次测定的各挥发性组分的RSD值为2.58%～26.83%，大部分挥发性成分的RSD值均小于20%，表明该方法的精密度可满足松露中挥发性成分的测定要求。优化方法灵敏度强，分离效率高，分析速度快，且所需样品量少。该方法合适于后期对松露类样品中挥发性成分的测定。

通过所建立的方法对7 个不同产地来源印度松露的挥发性成分进行测定，结果表明松露中主要挥发性成分含量较多的是酯类和醛类，平均占比为31.89%和23.90%。不同产地印度松露的挥发性成分个数及挥发性成分总量最高的是产自云南省富民县的印度松露，含有91个挥发性成分，挥发性成分总量为83.6%。