罕见抗-M鉴别分析:附1例报道*

邹 昕,虞 茜,马思飞,杨红梅△

1.江苏省常州市中心血站输血研究室,江苏常州 213004;2.江苏省常州市临床输血重点专科实验室,江苏常州 213004

MNS血型系统是第2个被发现的血型系统,目前大约包括 50个抗原。抗-M是较常见的“天然抗体”,国内有研究报道,产前抗体筛查中抗-M被列为继Rh血型系统的第2位常见抗体,大多数抗-M只在低于37 ℃有反应,最适反应温度为4 ℃[1]。常州市中心血站在献血者筛查中发现1个特殊案例,血浆中存在一种罕见的抗-M,影响ABO血型鉴定,但这种抗-M不与其自身M抗原阳性红细胞凝集。现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 献血者,女,30岁,江苏常州人,汉族,2022年4月12日首次无偿献血,在常州市中心血站检验科筛查的过程中发现其ABO血型正定型为B型,反定型为O型,因正反定型不符送EDTA抗凝血和非抗凝血标本到常州市中心血站输血研究室进行血型鉴定。

1.2仪器与试剂 日本久保田KA-2200血清学专用离心机;上海跃进医疗37 ℃恒温水浴箱;强生ORTHOTM Workstation离心机。抗-A/B单克隆抗体(批号:20201221)、抗-D(IgM)单克隆抗体(批号:20201201104)、ABO血型反定型红细胞(批号:20225309)、抗-M和抗-N(批号:20211011、20200709)、2-Me(批号:20217701)、酸放散试剂盒(批号:20212101)均购自上海血液生物公司;抗体筛选细胞和谱细胞(批号:702205、732205)购自德国CE公司;抗人球蛋白卡(批号:AHC228H)购自强生公司;人源抗-M(批号:20220128)自制。

1.3方法

1.3.1血清学检测 用试管法进行ABO、Rh血型鉴定;用试管法、凝胶卡法进行直接抗球蛋白试验和不规则抗体筛查;应用谱细胞进行不规则抗体鉴定;用等比稀释法进行抗体效价检测。所有试验严格按照《全国临床检验操作规程》[2]及试剂说明书进行操作。

1.3.2吸收放散试验 用生理盐水洗涤3次所需压积细胞1 mL(O型分别为MN型、MM型、NN型红细胞以及自身红细胞),均加入等量受检血清混匀,放入4 ℃冰箱吸收60 min ,其间摇动混匀2～3次,离心去上清液,然后用4 ℃生理盐水洗涤6次,取第6次洗涤液作为对照,分别加入与红细胞等量的生理盐水,56 ℃水浴热放散10 min,其间摇动混匀2～3次,离心取放散液,挑选相应的谱细胞进行检测。

1.3.3MN基因测序分析和序列比对 该实验部分由天津秀鹏公司完成。根据GenBank 的NG-007470基因参照序列,使用Oligo 软件自行设计GYPA 基因第2外显子的上、下游引物,进行扩增,PCR产物测序及序列比对。

2 结 果

2.1ABO/MNS血型血清学实验结果 该献血者血型正定型为B型,反定型结果显示血清与A、 B、O细胞均为凝集状态,但与自身细胞无凝集,红细胞与单克隆抗-M及人源抗-M反应均有凝集,该献血者MNS血型见表1。用经筛选出M阴性的Ac、Bc、Oc献血者红细胞做反定型,结果为B型。

表1 该献血者ABO/MNS血型血清学实验结果

2.2直接抗球蛋白试验 多特异性抗球蛋白、抗-IgG、抗-C3d均为阴性。

2.3抗体鉴定 该献血者反定型结果提示其体内有不规则抗体,进一步进行抗体鉴定。其血浆与德国CE谱细胞(批号:732205)反应,在盐水、聚凝胺、抗球蛋白凝胶卡试管法中结果符合IgM型的抗-M。用酶处理细胞进一步进行抗体鉴定,实验结果均为阴性。为了排除IgM抗体的干扰,血清与等量的2-Me在37 ℃孵育30 min,继续抗体鉴定结果均为阴性。

2.4吸收放散试验 将该献血者血浆分别用O型的MM、NN型红细胞以及自身红细胞吸收;该献血者的红细胞用人源抗-M血清吸收,再进行热放散。放散液与相应的谱细胞(1、3、4号)反应结果见表2。

表2 吸收放散试验结果

2.5抗体效价测定 用纯合子MM型细胞作效价测定,试管法检测该抗-M效价为16。

2.6MN基因测序分析和序列比对 基因测序GYPA 第2外显子59位C>T,71位G>A,72位T>G(均为杂合峰)。测序结果显示标本基因分型结果与血清学分型结果相符为MN型,碱基序列未发现异常突变。特征序列见图1。

图1 基因测序GYPA 第2外显子结果

3 讨 论

类同种特异性自身抗体(简称类抗体),被认为具有明显红细胞同种抗体特异性,又能被该特异性抗原阴性的红细胞吸收的一类抗体,而真正的同种抗体仅能被抗原阳性的红细胞吸收[3-5]。通常情况下,红细胞表面存在相关的抗原,而血浆中不应存在该抗原对应的抗体。该献血者血清在盐水介质中检测出明显特异性抗-M,自身有M抗原,与自身细胞不凝集,结果相矛盾不符合常理,因此排除类抗-M。有研究表明人类红细胞MNS血型中抗-M的产生与M抗原是否存在没有必然关联,与相关基因GYPA的表达也无明显关联[6-7],为了研究这个问题从两方面着手考虑:(1)该检测的抗体是否为抗-M;(2)该检测的抗原是否为M抗原。

笔者又用进口Sanquin(批号:800451970)的16份谱细胞鉴定,再次证实该抗体有抗-M特异性。有文献报道抗-M1同样具有抗-M特异性,研究发现早期的抗-M1是在NN个体血清中和抗-M一起被发现的,M1只在M阳性红细胞上存在,抗原在非洲裔人群中频率高达24%,而在白种人中频率为4%[8]。抗-M1也被认为是唯一的特异性,与抗-M不同,但又有交叉反应,在谱细胞上显示没有剂量效应,不符合积分规律。本案例中谱细胞凝集强度具有明显的剂量效应,基本排除该抗体为抗-M1。用吸收放散试验进一步证明献血者抗-M能被异体的M抗原阳性的细胞吸收放散,但不能被M抗原阴性和自身细胞吸收放散,且没有证据表明献血者体内红细胞被自身抗体破坏,能排除该抗-M为自身抗体。早期文献中发现在M抗原阳性的个体血清中鉴定出类抗-M同种抗体,这种抗体与自身细胞不反应,患者的类抗-M和他的MN型孩子的细胞均不反应,与MN型姐妹也不发生反应[9]。鉴于吸收放散试验结果,该献血者的血浆不能输注给M阳性患者,若为受血者,需要输注交叉配血相合的M阴性血液。

MNS系统本身也是一个复杂的系统,很多抗原能够发生交叉反应。比如一些单克隆抗-M与He会有交叉反应,但是多克隆抗-M不涉及这种交叉反应问题[8]。因此笔者用人源的抗-M鉴定进一步证实该献血者为M抗原阳性。MNS血型系统基因多态性的产生机制主要有单核苷酸突变(相关抗原如 S/s、Mit等)、两个或多个核苷酸突变(如 M/N抗原等)、基因转换(如 Mia、Mur抗原等)、基因不等位交换[8](如 Hil 抗原等)。该献血者MN基因测序分析和序列比对结果与血清学分型结果相符为MN型,碱基序列未发现异常突变。还有一种情况由于GYPA和GYPB发生了不等交换产生了变异体GP.Hil表型红细胞,它不仅是一个表达GP(B-A)血型蛋白的杂交基因,而且其两侧有正常的GYPA和GYPB[10]。这样的杂交子可以解释异常的MNS表型。献血者血清学分型结果为MN型但其凝集强度偏弱,MN基因测序分析和序列比对结果也为MN型。由于实验条件有限,本案例没有应用免疫印迹技术进一步鉴定血型糖蛋白,对其蛋白结构是否有变化无法判断,条件允许的情况下可以做家系调查,同时还应分析该例抗-M与其他人类和单克隆抗-M的性能区别,如不同人的红细胞M血型检测、吸收放散试验,还要检测吸收后血浆中的抗-M活性。

综上所述,MNS系统的相应抗原复杂且多样化,本文报道的该例献血者红细胞上既有M抗原,血清中又检出抗-M,因此将血型血清学和分子生物学方法相结合才能更准确地鉴定标本。该献血者血浆中存在一种罕见的抗-M,这种抗-M不与M抗原阳性的自身红细胞凝集,但与异体M阳性红细胞反应,其血浆不能输注给M阳性的患者,患者输血时应该选择交叉配血相容的M阴性红细胞。