茶叶斑病病原菌Epicoccum mackenziei致病性与生长特性研究

吴 双,张 骏,江仕龙,2,李冬雪,唐 芹,马友力,3,王德炉,陈 卓*

(1.贵州大学 绿色农药与农业生物工程教育部重点实验室,贵州 贵阳 550025;2.贵州大学 农学院,贵州 贵阳 550025;3.贵州大学 茶学院,贵州 贵阳 550025; 4.贵州大学 林学院,贵州 贵阳 550025)

茶树(Camelliasinensis(L.)Kuntz)作为一种非常重要的经济作物,在中国被广泛种植。2021年贵州省茶园面积达714.6万亩,种茶面积连续十年位居中国第一,是中国主要的茶叶产区[1-3]。由于受低纬度、高海拔、寡日照、多云雾及倒春寒天气频发等因素的影响,贵州省茶树病害发生流行较为复杂,对茶叶产量以及品质的影响较大[4]。如陆续发现Colletotrichumcamelliae引起的茶炭疽病[5],Pseudopestalotiopsiscamelliae-sinensis引起的茶轮斑病[6],以及Diaporthenobilis[7]、Phomasegeticolavar.camelliae[8]、Lasiodiplodiatheobromae[2,9]、Epicoccumsorghinum[1]、Epicoccumnigrum[10]、Didymellabellidis[11]等病原菌引起的茶叶斑病;Exobasidiumvexans引起的茶饼病[12]以及Elsinoeleucospila引起的茶白星病[13]。因此,贵州茶树病害的防治对茶叶品质和产量至关重要。目前针对Epicoccummackenziei引起的植物病害研究报道较少,但其隶属于Epicoccum,Epicoccum大多是腐生,可引起多种植物的病害。本课题组于2020年至2021年,在贵州省思南县、石阡县和开阳县的茶园进行田间调查,调查发现该区域发生茶叶斑病,其中发现12个茶园中茶叶斑病的发生率约51%～58%,病害严重度约34%～43%。这些茶叶斑病对茶叶产量和品质构成一定的影响。因此,为了探明该病害的病原,并提出有效的防控措施,本文对贵州省上述茶叶产区的茶叶斑病进行了病原鉴定、致病性分析和生物学特性的初步研究。

1 材料与方法

1.1 病样采集

2020年至2021年,团队在贵州省思南县(27.74°N,108.35°E)、石阡县(27.74°N,107.56°E)和开阳县(27.96°N,107.34°E)的12个茶园采集了19个发生典型叶斑病病害症状的茶叶枝条,并记录茶树叶斑病病害发生特征。

1.2 菌株的分离和纯化

将采集到的自然发病茶树病叶带回实验室,采用改良的组织法[2],从病害样本中分离病原菌[14]。将叶片从病变组织和健康组织的交界处切成约3 mm×3 mm的小叶块,然后用75%乙醇表面消毒30 s,接着用0.5%次氯酸钠浸泡5 min,后用无菌水漂洗3次。将消毒后的组织块接种至马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar,PDA),并在生化培养箱(上海博迅医疗生物仪器股份有限公司)中培养,在25℃的黑暗环境下培养3～5 d。通过在PDA上进行多轮次培养,进一步纯化真菌菌株。菌株SN2-3、KY45、SQ2-2和SQ2-15已寄送至中国普通微生物菌种保藏管理中心和中国农业微生物菌种保藏管理中心进行保存,菌株保藏号分别为CGMCC 3.20225、ACCC 35051、ACCC 35053和ACCC 35054。然后将6 mm菌碟转移至不同种类的培养基中生长并观察菌株的生长特性。

1.3 形态学观察

将菌株CGMCC 3.20225、ACCC 35051、ACCC 35053和ACCC 35054接种到PDA上培养活化,并取6 mm菌碟接种至PDA、麦芽浸粉琼脂培养基(Malt Extract Agar,MEA)和燕麦片琼脂培养基(Oatmeal Agar,OA)。在25 ℃和黑暗条件下,持续培养。观察菌株在3种培养基上的菌落生长情况、菌落形态特征、菌丝丰度及色素分泌等特征。同时,将灭菌的松针置于PDA培养基诱导菌丝产孢,观察菌株的产孢特征。待产孢后,采用奥林巴斯显微镜(Olympus,BX43和FVMPE-RS)观察致病菌的产孢结构和分生孢子的形态[11,15-16]。

1.4 致病性测定

根据文献方法[14],将分离获得的菌株接种至茶树叶片进行致病性测定。以福鼎大白茶(C.sinensiscv.Fuding-dabaicha)为致病性试验的茶叶品种,茶树种植于贵州省贵阳市贵州大学(26.26°N,106.40°E)大棚温室内,温室白天和晚上保持在25 ℃,周期为14 h光照和10 h黑暗,相对湿度为70%～80%,茶树树龄约5年。在实验室条件下,选择健康植株的前3叶进行接种研究。接种方式采用损伤方式和无损方式,其中损伤方式采用无菌针头针刺相邻的孔。在前3片叶子上分别接种来自真菌培养物的分生孢子悬浮液(106CFU/mL)或菌丝塞(PDA上培养5 d,直径6 mm),并以无菌PDA或无菌水作为对照。田间致病性试验地在贵州省花溪区久安村(27.74°N,108.35°E,海拔575 m)。茶树品种为福鼎大白茶,茶树树龄为30年,茶树叶龄为40 d。田间致病性试验前30 d,茶园未采用农药进行防治。田间试验采用菌碟和分生孢子悬浮液进行接种,接种方式采用损伤和无损的方式。试验独立重复3次。每个处理在15株茶树的15根枝条进行。

1.5 分子鉴定

采用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒及按照使用说明提取病原菌菌丝DNA。对内转录间隔区(The internal transcribed spacer,ITS)、部分28S大亚单位rDNA(the partial 28S large subunit rDNA,LSU)、RNA聚合酶II第二大亚基(RNA polymerase II second largest subunit,RPB2)和β-微管蛋白基因(beta-tubulin,TUB)进行扩增,引物分别采用ITS1/ITS4[17]、LR0R/LR5[18-19]、RPB2-5F2/fRPB2-7cR[20-21]和TUB2Fd/TUB4Rd[22]。采用HS Taq酶(Takara,宝生物大连公司)试剂进行PCR检测。反应程序:94 ℃,预变性2 min;98 ℃变性10 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸40 s,35个循环;72 ℃再延伸5 min。PCR产物送北京擎科生物技术有限公司进行基因测序,测序结果提交至GenBank。结合ITS序列的BLAST比对结果,选择参比序列。利用DNAMAN 8.0软件进行拼接及序列多重比对。采用PAUP v4.0b10(Swofford 2003)及最大简约法(Maximum Parsimony,MP)进行聚类分析及进化树构建,基因的系统进化树分析方法选择Bootstrap,重复次数为1000,最大的树数目设置为10 000。

1.6 菌株生长特性的测定

采用文献方法[23-24],研究菌株CGMCC 3.20225、ACCC 35051、ACCC 35053和ACCC 35054在PDA、OA和MEA培养基上的生长速率、菌落形态和菌丝色素。菌株生长于25 ℃和黑暗条件。每个处理设5次重复,试验独立重复3次。

1.7 数据分析

使用SPSS19.0软件进行统计分析。采用方差分析(ANOVA),以最小显著法(Least-significant difference,LSD)分析不同处理组间的差异显著性,以不同小写字母表示差异是否显著。

2 结果与分析

2.1 茶叶斑病的田间症状

据田间调查表明,茶叶斑病多发于茶树嫩芽和嫩叶,尤其是叶片边缘。发病初期为淡褐色小叶斑,随着发病时间延长,病斑逐渐变为红褐色,并扩大至1～2 mm。当病斑数量增多后,相邻病斑可融合形成不规则较大的病斑,叶片枯萎,变形,颜色失泽,叶片柔韧度降低(图1)。

注:圆圈内为叶斑病的症状。

2.2 茶树叶斑病病原鉴定

2.2.1形态学特征

EpicoccummackenzieiCGMCC 3.20225菌株接种至MEA培养基上,在25 ℃和黑暗条件下培养10 d,培养基表面产生孢子囊,大小约100～500 μm,呈黑色球状或液滴状(图2-a)。压碎孢子囊后镜检,发现孢子囊内有分生孢子器,分生孢子器的细胞壁上有产孢细胞,和不同成熟度的分生孢子,颜色深浅不一(图2-b)。厚垣孢子呈深褐色半透明状,带有疣状突起或瘤状突起,单生或成链状,范围在(10.92±2.48)μm×(9.93±2.89)μm(n=50)(图2-c)。分生孢子为单细胞或多细胞,灰色,球形或梨形,直径分别为(14.58±1.76)μm(长)和(9.39±1.87)μm(宽)(n=50)(图2-d)。经与文献比较,发现菌株的形态特征与E.mackenziei相似[25]。

注:a.分生孢子器;b.产孢细胞和分生孢子;c.厚垣孢子;d.分生孢子。

2.2.2病原菌的致病性

室内致病性试验表明,接种菌碟24 h后,第一叶、第二叶和第三叶均有病斑形成(图3-a)。接种48 h后,病斑逐渐扩大,特别是第一叶,而第二叶和第三叶的病害变化不明显(图3b～d)。接种分生孢子悬浮液后,分生孢子萌发和茶叶病变时间相对较长,分生孢子接种处理的病斑比菌碟接种处理的病斑小(图3～f)。针对接种无菌PDA或无菌水的对照处理,前3叶均没有观察到症状(图3～e)。此外,接种茶树茎部72 h后,也观察到病斑(图3～g)。田间致病性试验表明,在接种菌碟2 d后,田间的病害症状与实验室病害症状相同。同时,以分生孢子悬浮液接种的茶叶病害比菌碟接种的茶叶病害弱(图3～i)。对照组处理没有出现病害症状(图3～j)。

注:a～h:室内致病试验。a～e.菌碟的致病性试验。a.顶部前三叶;b.第一叶;c.第二叶;d.第三叶;e.对照处理。f.分生孢子悬浮液的致病性试验;g～h:茶树茎部致病性试验(g.菌碟的致病性试验;h.无菌PDA的对照试验);i～j:田间致病性试验(i.菌碟的致病性试验;j.无菌PDA的对照试验)。箭头所指为病斑或接种位置。

2.2.3分子生物学鉴定

向Genbank提交菌株的基因或核酸的序列(表1)。采用BLAST进行序列比对,结合文献选择模式菌株,下载对应的基因序列。对ITS(1-485)、LSU(486-1387)、RPB2(1388-2009)和TUB(2010-2265)进行串联加合,总长为2 265 268个的变异位点(variable characters,VC)是简约信息位点(parsimony-uninformative),信息位点数(parsimony-informative characters)为938个。树长为1725。采用PAUP v 4.0b10进行系统发育树构建,系统发育树参数如下:Consistency index(CI)=0.793,Homoplasy index(HI)=0.206,Retention index(RI)=0.806,Rescaled consistency index(RC)=0.639,CGMCC 3.20225、EpicoccummackenzieiACCC 35051、EpicoccummackenzieiACCC 35053和EpicoccummackenzieiACCC 35054聚为一支(图4)。外群为DidymellaamericanaCBS 185.85和DidymellaamericanaCBS 568.97。

表1 4个E.mackenziei菌株的基因或核酸序列

图4 4个代表性菌株E.mackenziei的多基因系统发育树

2.3 病原菌生物学特性

将6 mm的PDA菌碟转移到PDA(图5a～f)、MEA(图5g～l)和OA(图5m～r)培养基上,并在25 ℃和黑暗条件下培养。菌落在3种培养基上呈现出丰富的菌丝体(图5a～r)。

注:a～f:菌株接种至PDA(a～b,5 d; c～d,10 d; e～f,15 d; a,c和e,正面; b,d和f,反面);g～l:菌株接种至MEA(g～h,5 d; i～j,10 d; k～l,15 d; g,i和k,正面; h,j和l,反面);m～r:菌株接种至OA(m～n,5 d; o～p,10 d; q～r,15 d; m,o和q,正面; n,p和r,反面)。

CGMCC 3.20225菌株在PDA上培养5 d,菌落中央的颜色呈浅绿色(图5-a),背面呈深红色,边缘有黄色圆圈(图5-b);接种10 d或15 d,菌落颜色呈灰白色,背面边缘呈黄色且逐渐扩大,中央的红色逐渐加深(图5c～f)。

接种菌株至MEA上生长5 d,菌落中央的颜色呈灰白色(图5-g),背面中央呈红褐色,边缘呈黄色(图5～h);接种10 d或15 d,菌落种养颜色逐渐加深,有黑色、黑褐色油滴状、球状物产生,半浸入在培养基表面,大小约100～2000 μm(图5i～l)。

接种菌株至OA上生长5 d,菌落中央颜色呈白色(图5～m),背面呈灰色(图5～n)。接种10 d或15 d,菌落具有丰富的菌丝体,显著多于菌株在PDA和MEA上(图5o～r)。

CGMCC 3.20225、ACCC 35051、ACCC 35053和ACCC 35054菌株在MEA上的菌丝生长速率较高,其次是在OA和PDA上(图6)。

注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

3 结论与讨论

根据形态学鉴定、多基因系统发育树分析和致病性试验的方法,本研究从贵州省思南县、石阡县和开阳县的茶叶斑病中分离鉴定了致病菌E.mackenziei。目前,关于E.mackenziei的研究报道较少,E.mackenziei首先是从芒柄花(Ononisspinosa)坏死的茎上分离获得,作者观察了其子囊果、拟侧丝、子囊、子囊孢子的形态特征,同时,通过系统进化树分析发现其与E.nigrum遗传距离较近[25]。茶叶斑病的病原菌种类复杂,其致病机制及病害发生流行规律尚不清晰,本研究团队先后从贵州茶区的茶叶斑病中分离出Didymellasegeticola、D.bellidis、E.sorghinum、E.nigrum,这些菌株均属于Didymellaceae家族的成员[1,8,10-11]。此外,有研究表明E.layuense也可以引起茶叶斑病[26],同样,本研究小组在开阳县毛云乡也发现了E.layuense引起茶叶斑病的样本(E.layuenseACCC35052,ITS:OP975751,LSU:OP975775)。作为Didymellaceae家族的成员,D.segeticola、D.bellidis、E.sorghinum、E.nigrum和E.layuense虽然都可以导致茶叶斑病,但其症状略有不同。我们认为这可能与病原菌生物学特性、茶树品种与抗病力、茶树微生物群落等因素有关,这还需要进一步深入研究,以期为茶树病害提供有效防治措施。