循环miR-27a-3p水平与新发皮质下小梗死严重程度及短期神经功能预后的关系*

周婵娟,龙发青,王文菊,赵仕玉

1.海南省东方市人民医院神经内科,海南东方 572600;2.海南医学院第二附属医院神经内科,海南海口 570311

脑小血管病(CSVD)是指影响大脑小动脉、微动脉、毛细血管和小静脉的多种病理过程[1]。CSVD相关急性脑损伤的核心机制被认为是缺血,缺血通过小动脉狭窄或闭塞导致脑组织局灶性损伤,与结构或功能无关(如血管痉挛、自我调节受损或低血压)[2]。新发皮质下小梗死(RSSI)是CSVD的关键颅脑磁共振成像(MRI)特征之一[3]。CSVD的发病机制复杂,有研究认为其可能与内皮功能障碍和血脑屏障破坏有关[4]。微小RNA(miRNA)是一类小的非编码单链RNA(长度约为19～24个核苷酸),通过与信使转录本的互补区域结合来抑制翻译并调节其靶mRNA的降解[5]。存在于生物体液中的miRNA高度稳定,可作为癌症、急性脑梗死和神经退行性疾病的可靠标志物[6-10]。有研究显示,急性缺血性脑梗死患者血清外泌体中miR-27a-3p呈高表达,而且通过miR-27a-3p/PPARγ轴加重脑部炎症,进而影响患者预后[8]。miR-27a-3p被认为是脑小血管内皮细胞磷酸二酯酶3a(PDE3A)的新型调节剂[11]。然而,miR-27a-3p作为重要的血管生成miRNA是否影响CSVD的发病鲜见相关研究。基于实验室、影像学和临床评估之间的相关性,本研究旨在探讨循环miR-27a-3p与RSSI发病后14 d内短期预后之间的相关性。

1 资料与方法

1.1一般资料 本研究为一项前瞻性研究,选取2018年5月至2021年6月海南省东方市人民医院神经内科收治的RSSI患者153例作为RSSI组,另选取同期体检健康者150例作为对照组。RSSI被定义为由单一穿支动脉闭塞引起的新发深部小梗死,导致其供血区脑组织缺血性坏死。纳入标准:(1)年龄≤75岁;(2)首次发病,发病时间<48 h;(3)RSSI患者的MRI上表现出典型的脑梗死症状和体征,缺血性病灶<20 mm;(4)具有完整临床、实验室、影像学相关资料。排除标准:(1)颈动脉或颅内动脉狭窄>50%,心源性卒中、既往心脑血管疾病;(2)合并严重肝或肾功能损伤及风湿免疫病和恶性肿瘤等炎症相关疾病。RSSI组中男89例,女64例;平均年龄(61.72±11.19)岁;对照组中男77例,女73例;平均年龄(60.69±11.86)岁。两组性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。本研究根据赫尔辛基宣言进行,并经海南省东方市人民医院伦理审查委员会批准,所有参与者均知情同意。

1.2观察指标

1.2.1一般临床资料收集 包括年龄、性别、生命体征(血压和脉搏)、病史(高血压和糖尿病)、个人病史[吸烟史(连续吸烟1年以上,吸烟>1支/天)和饮酒史(连续饮酒1年以上,摄入酒精量≥100 g/d)]和基本实验室检查[葡萄糖(Glu)、三酰甘油、总胆固醇、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL),白细胞计数(WBC)和尿酸(UA)]。所有对照组均接受心电图(ECG)和脑成像检查[头部计算机断层扫描(CT)或MRI],RSSI患者接受脑部MRI、颈动脉检查、脑血管检查[脑动脉CT成像(CTA)或脑动脉核磁成像(MRA)]、心脏超声、24 h动态心电图和头部磁敏感加权成像(SWI)检查。此外,记录患者入院时(基线)和诊断后14 d时的美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分,并计算ΔNIHSS(基线NIHSS-14 d时NIHSS)和NIHSS改善率[(基线NIHSS-14 d时NIHSS)/基线NIHSS)×100%]。

1.2.2CSVD影像学特征 所有RSSI患者均使用3.0T MRI检查,采用ABC/2法计算脑梗死体积。分别评估CSVD影像学特征。血管源性腔隙定义为直径在3～15 mm的皮质下圆形或卵圆形充满液体的腔隙(信号类似于脑脊液),病灶与先前穿支小动脉区域发生的急性RSSI或出血相一致。脑血管周围间隙扩大(EPVS)定义为穿过灰质或白质的沿着血管典型走向的充满液体的间隙,并进一步进行EPVS分级[12]:0、1、2、3、4级(对应的数量分别为0个、>0～10个、>10～20个、>20～40个、>40个)。血管源性脑白质高信号(WMH)定义为白质中大小不等的信号异常:T2加权像(T2WI)上的高信号;WMH分为脑室旁WMH(PVWMH)和深部WMH(DWMH),采用Fazekas量表进行分级[13]。脑微出血(CMB)定义为SWI上显示低信号的小圆形病灶(直径<10 mm),分为脑叶CMB和深部CMB。CSVD MRI总负荷评分规则[14]:存在腔隙、存在CMB、EPVS的数量≥11个、Fazekas分级≥2,每项评分为1分,共4分。

1.2.3miR-27a-3p检测 采集所有研究对象清晨(早晨7～9点)空腹静脉血样。按照RNA提取试剂盒(中国大连Takara生物技术有限公司)的说明书提取全血样本总RNA,并检测其浓度。使用PrimeScript miRNA cDNA合成试剂盒(Takara)进行逆转录得到cDNA。按照SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(Takara)的说明,以cDNA为模板,应用Applied Biosystems 7500系统进行实时荧光定量PCR,95 ℃持续10 min,45次循环(95 ℃持续10 min,60 ℃持续1 min)。对每个样品进行重复分析。以U6为内参,采用2-ΔΔCt法计算miR-27a-3p相对表达水平。引物如下:miR-27a-3p的正向引物为5′-TTCACAGTGGCTAAGTTCCGC-3′、反向引物为5′-AGGG CTTAGCTGCTTGTGAGCA-3′;U6的正向引物为5′-CGCTTCGGCAGCACATATACTAA-3′、反向引物为5′-TATGGAACGCTTCACGAATTTGC-3′。

2 结 果

2.1临床资料比较 此外,RSSI组有高血压病史、吸烟史的比例及WBC、循环miR-27a-3p水平显著高于对照组(P<0.05),TC、LDL、HDL水平低于对照组(P<0.05),而两组其他资料比较,差异均无统计学意义(P>0.05),见表1。

表1 临床资料比较[M(P25,P75)或n(%)或

2.2循环miR-27a-3p水平与梗死体积的相关性 经Spearman秩相关系数分析,RSSI患者循环miR-27a-3p水平与梗死体积呈正相关(r=0.357,P<0.001),进一步校正年龄、性别、高血压史、糖尿病史、吸烟史、饮酒史、TG、TC、HDL、LDL、Glu等混杂参数后,经多元线性回归分析,循环miR-27a-3p水平与梗死体积仍呈正相关(β=0.410,95%CI:0.197～0.624,P<0.001)。

图1 循环miR-27a-3p水平与梗死体积的相关性

2.3循环miR-27a-3p水平与MRI总负荷特征之间的相关性 CSVD MRI总负荷特征中,循环miR-27a-3p水平与WMH-Fazekas分级和EPVS分级有关(P<0.05)。见表2。经Spearman秩相关系数分析,RSSI患者循环miR-27a-3p水平与MRI总负荷(r=0.415,P<0.001)、WMH-Fazekas分级(r=0.546,P<0.001)、EPVS分级(r=0.207,P=0.010)呈正相关,见图2。进一步校正年龄、性别、高血压史、糖尿病史、吸烟史、饮酒史、TG、TC、HDL、LDL、Glu等混杂参数后,经多元线性回归分析,循环miR-27a-3p水平与MRI总负荷(β=0.224,95%CI:0.136～0.313,P<0.001)、WMH-Fazekas分级(β=0.166,95%CI:0.115～0.217,P<0.001)、EPVS分级(β=1.101,95%CI:0.225～1.976,P=0.014)仍呈正相关。

注:A、B、C分别为MRI总负荷、WMH-Fazekas分级、EPVS分级之间的相关性散点图。

表2 不同MRI总负荷特征患者的循环miR-27a-3p水平比较[M(P25,P75)]

2.4循环miR-27a-3p水平与短期神经功能预后的相关性 RSSI患者基线时、14 d时的NIHSS和14 d时ΔNIHSS分别为2.00(1.00,5.00)、2.00(0.00,4.00)、0.00(0.00,1.00)分,NIHSS改善率为0.00%(0.00%,0.50%)。经Spearman秩相关系数分析,RSSI患者循环miR-27a-3p水平与ΔNIHSS(r=0.370,P<0.001)、NIHSS改善率(r=0.644,P<0.001)呈正相关,而与基线NIHSS无相关性(P=0.446),见图3。进一步校正年龄、性别、高血压史、糖尿病史、吸烟史、饮酒史、TG、TC、HDL、LDL、Glu等混杂参数后,经多元线性回归分析,循环miR-27a-3p水平与ΔNIHSS(β=0.209,95%CI:0.120～0.298,P<0.001)、NIHSS改善率(β=0.137,95%CI:0.099～0.175,P<0.001)仍呈正相关。

注:A、B分别为循环miR-27a-3p水平与发病14 d时ΔNIHSS和NIHSS改善率的相关性散点图。

3 讨 论

本研究结果发现,RSSI组的循环miR-27a-3p水平显著高于对照组,循环miR-27a-3p水平与梗死体积、MRI总负荷、WMH、EPVS及14 d时ΔNIHSS、NIHSS改善率均呈正相关,且校正混杂参数后,循环miR-27a-3p水平与上述指标仍呈正相关,提示循环miR-27a-3p高表达与RSSI严重程度和患者短期神经功能预后密切相关,这可能为临床指导CSVD治疗提供一定的经验。

目前有研究认为,内皮功能障碍和血脑屏障破坏与CSVD的发病机制有关[4]。在炎症的作用下,内皮损伤导致血脑屏障破坏、白质病变、神经元变性和死亡[15]。有研究表明,miRNA在生理和病理条件下可作为血脑屏障功能的多功能调节剂[7],在神经退行性疾病和神经炎症性疾病等许多脑部病变中都证明了血脑屏障相关miRNA的作用[7,16]。XI等[17]发现,miR-27a-3p可以对抗创伤性脑损伤后的神经元死亡和血脑屏障通透性和自噬激活。本研究发现,循环miR-27a-3p水平在RSSI患者中显著升高,且与脑梗死体积和MRI总负荷特征呈显著正相关,提示循环miR-27a-3p可能在CSVD发病机制中发挥重要作用。

已有研究证实,miRNA可以通过靶向特定的信使RNA来调节脑缺血性损伤[16,18]。YE等[8]报道miR-27a-3p通过靶向PPARγ加重急性脑梗死患者的脑损伤和炎症。YASMEEN等[11]证明,miR-27a-3p可靶向脑微血管内皮细胞中PDE3A蛋白,参与免疫调节、内皮完整性和神经发生。HARATI等[7]证明,miR-27a-3p通过靶向GSK3β基因并激活Wnt/β-catenin信号传导,是脑内皮关键紧密连接蛋白的正调节因子,可在以屏障功能受损为特征的神经系统疾病中保持脑内皮完整性。XI等[17]发现,miR-27a-3p通过靶向内皮水通道蛋白11防止血脑屏障破坏和脑损伤。上述研究证明了miR-27a-3p表达与人类脑血管疾病之间的关联,这些结果表明miR-27a-3p可能通过不同的信号通路调节内皮功能、血脑屏障和相关炎症反应,参与CSVD进展。在本研究中,较高的循环miR-27a-3p水平预示着更高的MRI总负荷评分及WMH和EPVS的严重程度。笔者推测循环miR-27a-3p参与了大脑炎症反应,导致与慢性和持续性炎症反应相关的WMH和EPVS发生[19],进而影响MRI总负荷。然而,笔者没有发现深部或脑叶CMB及腔隙与循环miR-27a-3p之间存在相关性,可能是由于CMB与高血压或淀粉样变性有关,但无法反映大脑持续的炎症反应[20];而腔隙通常被认为是由其他病变转化而来的,发病机制复杂,缺乏证据支持。

此外,笔者还发现miR-27a-3p的表达水平与患者14 d时ΔNIHSS、NIHSS改善率呈正相关。既往研究表明,miR-27a-3p可靶向神经元中的促凋亡蛋白,可能对减少神经元细胞死亡至关重要[11]。ZHANG等[21]研究提示,miR-27a-3p可通过靶向卵泡抑素样蛋白1(FSTL1)改善的氧-葡萄糖剥夺/再灌注诱导的神经细胞损伤。同时,以往的研究已经表明,细胞外糖蛋白FSTL1与心血管疾病和炎症性疾病有关,可加速神经元凋亡,并可能具有治疗缺血性卒中的潜力[22-23]。此外,YE等[8]报道,miR-27-3p可以靶向PPARγ,并影响小胶质细胞的激活。激活的PPARγ可以减少神经元死亡,具有神经保护作用,有助于缓解神经炎症[24]。而小胶质细胞被认为是大脑中不可缺少的免疫细胞,激活时可提示脑神经炎症[25]。上述研究和本研究均提示miR-27a-3p可能通过介导各种信号通路参与神经系统的修复过程,从而改善卒中预后。总之,循环miR-27a-3p水平反映了RSSI患者短期预后情况,其水平升高与短期神经功能修复良好相关,可为临床治疗提供一定参考。

综上所述,循环miR-27a-3p反映了RSSI的严重程度,有望作为短期神经功能预后的预测因子。在CSVD的影像学特征上,循环miR-27a-3p可以反映WMH和EPVS的严重程度,对脑血管疾病的诊断和治疗具有一定的指导意义。但本研究存在一定局限性,如纳入病例数较少、排除标准为颈动脉或颅内动脉狭窄>50%,可能未充分排除颈动脉斑块高负荷患者,而且循环miR-27a-3p在CSVD中的潜在机制尚不明确,未来仍需要更多的临床研究和动态观察来进一步证实其在RSSI中的临床应用价值。