血清Sirt1、Sestrin2与2型糖尿病并发糖尿病周围神经病变患者的关系研究*

关晓燕,王丽娟,宁聪华,闫雪梅,包建玲

新疆医科大学第一附属医院检验科,新疆乌鲁木齐 830054

2型糖尿病(T2DM)属于一种内分泌代谢综合征,临床表现为多饮、多食、多尿、消瘦或体质量下降,在我国成年人中T2DM患病率达10.9%[1]。目前T2DM尚无根治性手段,若血糖长期得不到有效控制,将导致多种慢性并发症,严重时可危及生命安全[2]。糖尿病周围神经病变(DPN)为T2DM并发症之一,发生率为10%～96%,常见临床症状有感觉障碍(肢端麻木、疼痛、烧灼感等)与肢体改变(关节变形、皮肤溃烂等),足部溃疡严重者需截肢[3]。因此,研究DPN发病的影响因素对于预防或延缓DPN具有重要意义。氧化应激和炎症反应在T2DM发生发展中扮演着重要角色,被认为是引发其慢性并发症的共同机制[4-5]:(1)氧化应激可下调细胞质嵌膜蛋白小窝蛋白-1(Cav-1)表达水平,促使DPN的发生;(2)前炎性细胞因子可与细胞外Toll样受体4(TLR4)结合,经由细胞内信号传导激活核转录因子kappa B(NF-κB),进而诱导单核、巨噬细胞产生炎性因子,引发炎症反应,最终导致DPN的发生。Sestrin2是一种应激诱导型蛋白,能够参与葡萄糖代谢调节及体内氧化还原稳态,生理条件下表达较低,而在氧化应激时其表达水平可明显上调,以减少活性氧(ROS)累积[6]。有研究表明,Sestrin2可通过多种信号途径防御各种病理性改变,如脂质代谢异常、胰岛素抵抗等,并与糖尿病及其并发症的发生密切相关[7]。沉默信息调节因子1(Sirt1)是一种多功能蛋白,能够参与调控糖脂代谢及氧化应激、炎症反应,在糖尿病大鼠中呈低表达,并与神经病变有一定联系[8]。鉴于上述背景,笔者推测Sirt1、Sestrin2与DPN可能有一定关系,为验证这一猜想,本研究拟分析血清Sirt1、Sestrin2与T2DM并发DPN患者的关系,为临床T2DM患者并发DPN诊治提供参考。

1 资料与方法

1.1一般资料 本研究经新疆医科大学第一附属医院伦理委员会批准,选取2020年3月至2022年3月新疆医科大学第一附属医院收治的T2DM患者142例,根据DPN发生情况分为非DPN组(85例)和DPN组(57例),另选取同期体检健康者为健康对照组(50例)。纳入标准:(1)符合T2DM诊断标准[9];(2)年龄≥18岁;(3)T2DM病程0.5～20.0年;(4)无精神系统疾病或其他内分泌疾病;(5)病历资料完整;(6)签署知情同意书。排除标准:(1)1型糖尿病;(2)有其他病因导致的神经病变如神经压迫、椎管狭窄等;(3)存在交流障碍;(4)合并恶性肿瘤、血液系统疾病、严重感染;(5)妊娠及哺乳期妇女。非DPN组中,男47例,女38例;年龄27～80岁,平均(61.62±8.36)岁;体质量指数(BMI)19～26 kg/m2,平均(22.36±2.10)kg/m2。DPN组中,男35例,女22例;年龄29～79岁,平均(64.24±9.78)岁;BMI 20～26 kg/m2,平均(22.89±2.43)kg/m2。健康对照组中,男31例,女19例;年龄25～79岁,平均(63.20±8.83)岁;BMI 19～25 kg/m2,平均(22.24±2.37)kg/m2。3组性别、年龄、BMI差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

1.2诊断标准

1.2.1T2DM诊断标准 参照《中国2型糖尿病防治指南(2017年版)》[9]中关于T2DM诊断标准:(1)出现典型糖尿病症状(烦渴多饮、多尿、多食、不明原因的体重下降)加上糖负荷后2 h血糖≥11.1 mmol/L;(2)空腹时的血浆葡萄糖浓度≥7.0 mmol/L;(3)葡萄糖负荷后2 h血糖无典型糖尿病症状者,需改日复查确认,血浆葡萄糖浓度≥11.1 mmol/L。

1.2.2DPN诊断标准 参照《中国2型糖尿病防治指南(2017年版)》[9]中关于DPN的诊断标准:(1)明确的T2DM病史;(2)T2DM诊断时或之后发生的周围神经病变;(3)临床症状和体征与DPN表现符合;(4)存在疼痛、感觉异常、麻木等症状,进行5项检查(震动觉、踝反射、针刺痛觉、温度觉、压力觉)时,发现任意1项异常;(5)排除其他病变如颈腰椎病变(神经根压迫、椎管狭窄、颈腰椎退行性变),脑梗死,格林-巴利综合征,严重动静脉血管病变(静脉栓塞、淋巴管炎)等,尚需鉴别药物尤其是化疗药物引起的神经毒性作用及肾功能不全引起的代谢毒物对神经的损伤。

1.3方法

1.3.1临床资料收集 收集患者的临床资料包括:T2DM病程、BMI、年龄、性别、吸烟史(每天吸烟≥1支且时间≥6个月)、饮酒史(每周饮酒≥1次且时间≥6个月)、糖尿病视网膜病变(DR)发生情况、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、血肌酐(Scr)、糖化血红蛋白(HbA1c)、载脂蛋白A1(ApoA1)、载脂蛋白B(ApoB)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、总抗氧化能力(T-AOC)、血清Sirt1、Sestrin2等。

1.3.2外周血指标检测 (1)外周血采集:T2DM患者于入院次日清晨、体检健康者于体检当日采集空腹静脉血5 mL,3 000 r/min离心处理30 min,半径10 cm,分离上层清液,置于冰箱-20 ℃保存。(2)血清指标检测:采用迈瑞BS-420全自动生化分析仪(武汉盛世达医疗设备有限公司)检测血清TG、TC、LDL、HDL、Scr、HbA1c、ApoA1、ApoB。酶联免疫吸附试验检测血清Sirt1、Sestrin2水平,血清Sirt1试剂盒购自上海科艾博生物技术有限公司,血清Sestrin2试剂盒购自武汉贝茵莱生物科技有限公司。硫代巴比妥酸法检测丙二醛MDA水平,试剂盒购自上海富雨生物科技有限公司。黄嘌呤氧化酶法检测SOD,试剂盒购自武汉赛培生物科技公司。Fe3+/Fe2+还原法检测T-AOC,试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。

1.3.3外周血单核细胞TLR-4和NF-κB信使核糖核酸(mRNA)表达水平检测 (1)分离外周血单核细胞:Ficoll密度梯度离心法。向离心管中加入人淋巴细胞分离液2 mL(杭州联科生物技术股份有限公司),再将0.9%氯化钠溶液1 mL(上海源叶生物科技有限公司)与外周静脉血1mL混合后加入离心管中,经3 500 r/min离心处理30 min,收集离心管内1～2层交界处(由下至上分为3层)的白色云雾状液体(以单核细胞为主),并加至4mL 0.9%氯化钠溶液中,以1 500 r/min离心处理10 min,即可获取目的细胞。(2)逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测:Trizol试剂盒(沈阳万类生物科技有限公司)提取细胞总RNA,Thermo超微量紫外分光光度计(北京智杰方远科技有限公司)测RNA浓度、纯度,Takara逆转录试剂盒(温州科淼生物科技有限公司)将总RNA逆转录为cDNA。通过ABI7500PCR仪(上海实维实验仪器技术有限公司)检测,反应体系(20 μL)如下,cDNA 1 μL、2×SYBR Green Mix10 μL、去离子水7.4 μL、上下游引物10 μmol/L分别0.8 μL。反应条件:95 ℃ 60 s,95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 45 s,循环40个。溶解曲线的反应条件为:95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,1.6 ℃/s速度。PCR扩增产物通过2%琼脂糖电泳分离,以2-ΔΔCt法计算TLR-4和NF-κB mRNA相对表达水平。引物序列如下,内参U6:上游5′-TTGCCGACAGGATGCAGAA-3′,下游5′-GCCGATCCACACGGAGTACT-3′;TLR-4:上游5′-CTACCCTGCGGAGATCAC-3′,下游5′-TAGGACAGCCAGGCCAGCAACA-3′;NF-κB:上游5′-TCACCCTGAGATGGGAGC-3′,下游5′-AGCTCTTCCTCCTCCACAT-3′。

2 结 果

2.1非DPN组与DPN组基本资料比较 DPN组年龄大于非DPN组(P<0.05),T2DM病程长于非DPN组(P<0.05),HbA1c水平高于非DPN组(P<0.05),TG、HDL水平低于非DPN组(P<0.05),DR发生率高于非DPN组(P<0.05)。见表1。

表1 研究对象基本资料[n(%)或

2.2健康对照组、非DPN组、DPN组血清Sirt1、Sestrin2水平比较 与健康对照组比较,非DPN组和DPN组血清Sirt1水平降低(P<0.05),血清Sestrin2水平升高(P<0.05);与非DPN组比较,DPN组血清Sirt1、Sestrin2水平降低(P<0.05)。见表2。

表2 健康对照组、非DPN组、DPN组血清Sirt1、Sestrin2水平比较

2.3非DPN组与DPN组氧化应激指标及外周血单核细胞TLR-4、NF-κB mRNA表达水平比较 与非DPN组比较,DPN组血清MDA及外周血单核细胞TLR-4、NF-κB mRNA表达水平升高(P<0.05),血清SOD水平降低(P<0.05),血清T-AOC水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 非DPN组与DPN组氧化应激指标及外周血单核细胞TLR-4、NF-κB mRNA表达水平比较

2.4分析血清Sirt1、Sestrin2与氧化应激指标、外周血单核细胞 TLR-4和NF-κB mRNA表达水平的相关性 Pearson检验结果显示,血清Sirt1、Sestrin2与SOD呈正相关(P<0.05),与MDA、TLR-4、NF-κB呈负相关(P<0.05)。见表4。

表4 相关性数据

2.5T2DM患者发生DPN的多因素分析 建立非条件Logistic回归模型,以本研究资料为样本,以T2DM患者发生DPN情况为应变量,赋值DPN=1,非DPN=0。以前述研究对象基本资料(表1)中P<0.05的指标和因素为自变量。将部分为连续数值的自变量,按两组总均值(适当取整)进行分段(分层),转化成两分类变量。回归过程采用逐步向前法,并反复试验优化调整自变量纳入顺序,以利先剔除部分因素(α剔除=0.10,α入选=0.05)。结果显示,年龄增大(≥63岁)、T2DM病程偏长(≥8年)、HbA1c水平升高(≥9%)、DR、HDL水平降低(<1 mmol/L)、Sirt1水平降低(<8 ng/mL)、Sestrin2水平降低(<14 ng/mL)是DPN的危险因素(P<0.05)。见表5。

表5 T2DM患者发生DPN的多因素分析

3 讨 论

DPN为T2DM的并发症之一,主要病理改变为神经受损,其发病机制与氧化应激和炎症反应有关[9-11]。临床预防DPN除了控制高血糖外,还需关注氧化应激、炎症反应等导致病情进一步发展的各种因素。MDA、SOD、T-AOC为氧化应激相关指标[12-14]。MDA是组织脂质过氧化产物(LPO)的终产物之一,可反映体内脂质过氧化水平;SOD为一种金属蛋白酶,其活性高低可反映组织自由基水平及脂质过氧化程度;T-AOC表示人体内非酶类与酶类抗氧化物总体水平,可以清除过高水平的ROS,维持体内氧化还原相对平衡。本研究中,与非DPN组比较,DPN组血清MDA水平升高,血清SOD水平降低,血清T-AOC无明显差异,提示氧化应激参与了T2DM患者的DPN发病过程。TLR-4/NF-κB作为信号传导通路在炎症反应中起重要作用,TLR-4能够识别细菌脂多糖,与其结合后可以激活NF-κB通路,进而引发炎症级联反应[15]。相关基础研究显示,DPN大鼠坐骨神经组织TLR4和NF-κB表达水平较健康大鼠升高[16],提示TLR-4/NF-κB在DPN中呈异常激活状态,与DPN形成密切相关,经治疗干预后TLR4/NF-κB蛋白水平明显减少,说明TLR-4/NF-κB通路可能与DPN进展和疗效相关,提示DPN发病过程中存在炎症反应过度激活的现象。

生理状况下,ROS在机体内水平极低,而且可被内源性的抗氧化系统有效清除;病理条件下,机体内ROS大量生成,抗氧化酶活性减弱,机体倾向于氧化状态,则会出现氧化应激反应[17]。Sestrin2作为一种应激诱导型蛋白,除具有抗氧化应激作用外,还在抗炎、抑制过度免疫反应等方面发挥重要效应,在代谢紊乱、神经病变等病理情况下,体内会代偿性分泌Sestrin2蛋白,发挥正向的保护效果。有研究显示,糖尿病肾病发生时Sestrin2水平降低,并可激活YAP-TEAD1通路促使系膜细胞增殖及细胞外基质合成[18]。Sestrin2水平降低已被证实会造成诸多不良影响,如胰岛素抵抗、糖尿病加速等[19]。研究显示,T2DM患者外周血中Sestrin2水平上升,在代谢紊乱中起关键作用[20],这与本研究结果有相符之处,即非DPN组和DPN组血清Sestrin2水平较健康对照组升高,Sestrin2具有抗氧化特性,Sestrin2水平升高或许是保护患者机体免受氧化应激损害的代偿反应。本研究结果显示,Sestrin2在DPN组患者血清中的水平明显低于非DPN组患者,可能是由于随着T2DM病情进展,Sestrin2代偿机制不足以调控细胞内环境,其表达逐步减少。此外,Sestrin2水平降低为DPN的危险因素,说明高水平Sestrin2对DPN发挥保护作用,其水平降低可能会促进DPN发生,提示Sestrin2有望成为DPN的临床预测指标。与此同时,本研究还发现,DPN患者Sestrin2水平与SOD呈正相关,与MDA、TLR-4、NF-κB呈负相关,提示上调Sestrin2水平或许可通过下调体内炎症和氧化应激反应进而影响DPN的发生。

Sirt1是一种去乙酰化酶,能够参与调节细胞凋亡、新陈代谢、基因转录、糖脂代谢、胰岛素分泌、炎症反应等,还可通过调控NF-κB、P53、eNOS等靶基因或蛋白而参与氧化应激损伤过程[21]。近年来,Sirt1的神经保护效应已在局部缺血性损伤、创伤性脑损伤及神经退行性疾病中得到证实[22]。有细胞学实验表明,在高糖刺激下,内皮细胞中Sirt1蛋白表达量明显降低,Sirt1激动剂白藜芦醇有助于减轻高糖所致的内皮细胞损伤[23]。有大鼠模型实验发现,与健康大鼠比较,DPN模型大鼠的Sirt1水平明显下调,经补阳还五汤干预后DPN大鼠的Sirt1水平明显升高,提示Sirt1或许与DPN发生、发展及病情转归有关[24]。本研究中,与非DPN组比较,DPN组血清Sirt1水平明显降低,说明Sirt1在DPN中存在异常表达,该蛋白可能参与了DPN发病过程。此外,Sirt1水平降低为DPN的危险因素,并与氧化应激指标和TLR-4、NF-κB水平存在相关性,推测DPN的发生可能与Sirt1水平降低导致对TLR-4/NF-κB炎症通路及氧化应激的抑制作用减弱有关。有学者认为,Sirt1可通过去乙酰化抑制NF-κB转录活性,进而发挥抗氧化应激损伤的作用[25],这或许可以解释上述推测。与此同时,年龄增大、T2DM病程偏长、HbA1c水平升高、DR、HDL水平降低也是DPN的危险因素,与既往研究结论一致[26-28],临床可将血清Sirt1、Sestrin2水平与临床危险因子结合应用于DPN早期预测。

综上所述,DPN患者血清Sirt1、Sestrin2水平下降,这或许与氧化应激、炎症反应过度激活有关,其有望成为预测DPN发生风险的分子标志物。在临床实践中,早期检测T2DM患者血清Sirt1、Sestrin2水平,有助于评估DPN风险性,制订个体化诊疗方案,改善患者预后。但Sirt1和Sestrin2之间有无关联,还需更多研究加以证实。