不同药敏试验方法检测耐碳青霉烯类革兰阴性杆菌对替加环素敏感性的效能评价*

谢国艳,周林艳,梁 斌,裴凌燕,王禹婷,李凤娇,刘庆中△

上海中医药大学附属市中医医院:1.检验科;2.病理科,上海 200071

替加环素是美国食品和药物管理局(FDA)批准应用于临床的首个甘氨酰四环素类抗菌药物,其抗菌谱广,抗菌活性强,能够治疗多重耐药(MDR)革兰阴性和革兰阳性细菌引起的感染[1-2]。在当前耐药菌广泛流行的背景下,替加环素已成为这些病原菌感染治疗的一线药物[3],但随着使用量的增加其耐药率也随之升高[1]。因此,根据药物敏感性试验(简称药敏试验)结果正确选择替加环素用于感染治疗,对减少和延缓细菌耐药性的产生至关重要。

目前,替加环素体外药敏试验方法主要有肉汤微量稀释(BMD)法和纸片扩散(KB)法,其中BMD法为参考方法[4]。虽然欧洲抗菌药物敏感性测试委员会(EUCAST)、FDA和英国抗菌化疗协会(BSAC)制定了适合少量菌种(大肠埃希菌和柯氏枸橼酸杆菌)对替加环素敏感性的最低抑菌浓度(MIC)折点,但至今美国临床和实验室标准协会(CLSI)仍缺乏相应的判读标准[4]。研究显示,不同的药敏试验方法检测替加环素的敏感性会存在差异,导致对其耐药性的判断出现错误[2]。BMD法结果虽然准确,但操作烦琐,临床上不易常规实行。因此,寻找简便易行、结果可靠的替代方法势在必行。本研究即拟评估临床上可用的仪器法、E-test法及KB法检测耐碳青霉烯革兰阴性杆菌对替加环素的敏感性,评估其与参考方法BMD法的一致性,以期获得不同菌种对应的最佳检测方法。

1 材料与方法

1.1材料来源 收集本院2020年8月至2022年3月临床分离的非重复耐碳青霉烯革兰阴性杆菌211株(其中肺炎克雷伯菌96株、鲍曼不动杆菌62株、大肠埃希菌48株和阴沟肠杆菌5株)。药敏试验质控菌株大肠埃希菌ATCC 25922由上海市临床检验中心提供。

1.2仪器与试剂 所有菌株经Vitek2 Compact全自动微生物鉴定仪鉴定,亚胺培南和/或美罗培南耐药性由配套药敏卡检测并经KB法确认。Vitek2 Compact全自动细菌鉴定仪及配套GN335药敏卡为法国梅里埃公司产品,替加环素标准品购自国家卫生健康委食品药品鉴定所,替加环素药敏纸片(15微克/片)为英国Oxoid公司产品,替加环素E-test试纸条为温州市康泰生物科技有限公司产品、水解酪蛋白(MH)肉汤为广东环凯微生物科技有限公司产品,水解酪蛋白琼脂(MH)平板购自上海伊华医学科技有限公司,替加环素缓冲液购自上海原科实业发展有限公司。

1.3试验方法 按照美国CLSI推荐的操作[4]进行。判读实验结果时质控菌株ATCC 25922的抑菌圈直径范围应为20～27 mm,MIC值范围应为0.03～0.25 μg/mL,以证明在控[4]。

1.3.1BMD法 将替加环素倍比稀释成0.062 5～32.000 0 μg/mL系列浓度的工作液,分别加入96孔无菌培养板,每孔100 μL,调节菌液至1.0×106CFU/mL,每孔加入100 μL,混匀,35 ℃培养16～20 h后观察结果,孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度即为MIC值[4]。

1.3.2KB法 调节菌液至0.5麦氏浊度单位,涂布于MH平板,待表面干后贴两张替加环素纸片于琼脂表面,其中一张纸片加6 μL替加环素复敏液(KB1法),另一张纸片不加替加环素复敏液(KB2法),35 ℃培养16～18 h,测量抑菌圈直径。

1.3.3仪器法 用Vitek 2 Compact全自动鉴定仪及GN335药敏卡进行药敏试验,具体操作参照说明书,仪器软件自动判读MIC值。

1.3.4E-test法 操作同KB法,将纸片换成E-test试纸条,标有刻度的一面向上贴于琼脂表面,35 ℃培养16～20 h,读取椭圆型抑菌圈与试纸条交界处刻度值,即为MIC值。

1.4判读标准 替加环素的敏感性参照FDA推荐的判断标准[5],见表1。

表1 替加环素敏感性的判定标准

1.5统计学处理 采用SPSS19.0软件进行统计学分析。计数资料以频数或百分率表示,组间比较采用χ2检验,P<0.05表示差异有统计学意义。各种被评估方法与参考方法(BMD法)比较分析参数如下,Kappa值(κ>0.750表示一致性好,κ<0.400表示一致性差);基本一致率(EA):被评估方法与参考方法所得MIC值相同或相差上下一个浓度梯度的菌株百分率;分类一致率(CA):被评估方法与参考方法的符合率;微小误差(mE):参考方法结果为敏感或耐药,被评估方法为中介;重大误差(ME):被评估方法将敏感判定为耐药;非常重大误差(VME):被评估方法将耐药判定为敏感。根据美国CLSI要求,可接受误差范围为:EA和CA≥90%,VME≤1.5%,ME≤3%,mE≤10%[6]。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1BMD法检测耐碳青霉烯革兰阴性杆菌的MIC值 96株肺炎克雷伯菌对替加环素的MIC50值(抑制50%菌株生长所需的MIC值)和MIC90值(抑制90%菌株生长所需的MIC值)分别为1.0、2.0 μg/mL,62株鲍曼不动杆菌的MIC50值和MIC90值分别为0.5、2.0 μg/mL,48株大肠埃希菌的MIC50值和MIC90值分别为0.5、1.0 μg/mL,5株阴沟肠杆菌的MIC50值和MIC90值分别为0.5、2.0 μg/mL。各菌种对替加环素MIC值的分布见表2。

表2 BMD法检测各菌种对替加环素的MIC值分布(n)

2.2两种KB法检测各菌种对药敏试验替加环素结果的比较 对于肺炎克雷伯菌,两种KB法检测的药敏结果比较差异均有统计学意义(P<0.05);对于鲍曼不动杆菌,两种KB法的敏感率比较差异有统计学意义(P<0.05);而对于大肠埃希就和阴沟肠杆菌,两种KB法的结果比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.34种被评估方法与BMD法检测耐碳青霉烯革兰阴性杆菌对替加环素的药敏试验结果比较 4种被评估方法检测大肠埃希菌和阴沟肠杆菌对替加环素的药敏试验结果与BMD法比较差异均无统计学意义(P>0.05);E-test法检测肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌对替加环素的药敏试验结果与BMD法比较差异均无统计学意义(P>0.05);KB1法检测鲍曼不动杆菌中介株对替加环素的药敏试验结果与BMD法比较差异有统计学意义(P<0.05);仪器法和KB2法检测肺炎克雷伯菌(敏感、中介、耐药株)和鲍曼不动杆菌(敏感、中介株)对替加环素的药敏试验结果与BMD法比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 4种被评估方法与BMD法检测各菌种对替加环素药敏试验结果比较[n(%)]

2.44种被评估方法与BMD法药敏试验结果的一致性比较 4种被评估方法与BMD法检测结果相比较,均未发现VME。E-test法检测4种细菌的药敏试验结果与BMD法相比,一致性好(κ>0.750),EA(94.8%～100.0%)、CA(91.7%～100%)和mE(0.0%～3.2%)均在可接受范围,未发现ME和VME。仪器法检测大肠埃希菌和阴沟肠杆菌的药敏试验结果与BMD法一致性好(κ=0.751、1.000),而对肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌则一致性较差(κ=0.209、0.316),具有较高的ME(4.2%和3.2%),尤其对鲍曼不动杆菌还同时存在mE偏高(11.3%)。KB1法检测4种细菌的药敏试验结果与BMD法的κ>0.750,EA、CA、mE、ME和VME均在可接受范围,而KB2法除大肠埃希菌外(κ=0.639),对其余菌种检测结果与BMD的一致性都不理想(κ<0.400)。见表4。

表4 4种被评估方法与BMD法药敏试验结果的一致性比较

3 讨 论

随着碳青霉烯类抗菌药物的广泛使用,细菌的耐药率不断增高,从而给该类抗菌药物的选择造成较大限制。替加环素针对临床上的MDR菌具有很高的活性,它可与细菌核糖体30S亚基结合,将氨酰-tRNA阻挡在核糖体A位外,从而阻碍细菌蛋白质的合成,被认为是治疗该类细菌严重感染的最后有效措施[7-8]。临床上,正确应用替加环素需要可靠的药敏试验方法进行指导,探寻便于实验室常规开展且结果可靠的替加环素敏感性检测方法尤为必要。有研究表明,FDA的替加环素敏感性判定折点优于EUCAST[9-10],因此本研究采用FDA的判读标准来评估各种方法检测各菌种对替加环素药敏试验结果的可靠性。

BMD法被称为药敏试验的“金标准”,可以准确、标准化地定量测定菌株对抗菌药物的MIC值,但对于大批量菌株的药敏试验,由于需要严格保证MH肉汤为新鲜配制[11],工作量大,耗时较长,临床上不易常规开展。E-test法操作简便、结果直观,适用于单个样本的检测[12],是传统基于稀释药敏试验方法的便捷替代品。本研究结果显示,E-test法检测耐碳青霉烯革兰阴性杆菌对替加环素的敏感性与BMD法具有非常好的一致性(κ>0.750),EA、CA、ME、mE、VME等评价指标均在可接受范围内,且所研究的4种细菌的药敏试验结果与BMD法比较均无明显差异,适合对替加环素敏感性的检测。E-test法检测价格较贵,难以在临床上大批量常规开展,但在常规方法不能准确检测药敏结果时,该方法不失为一种可靠的复检手段。

当前,微生物实验室常规开展药敏试验最多采用的是仪器法和KB法。仪器法高效、便捷,受到微生物检测人员青睐。本研究结果显示,仪器法检测大肠埃希菌和阴沟肠杆菌对替加环素的敏感性结果与BMD法具有较好的一致性,各项评价指标均在可接受范围;但检测肺炎克雷伯菌时替加环素的敏感率明显低于BMD法(P<0.05),而中介率和耐药率明显高于BMD法(P<0.05);检测鲍曼不动杆菌时替加环素的敏感率明显低于BMD法(P<0.05),中介率明显高于BMD法(P<0.05);这两种细菌的仪器法结果与BMD法相比,一致性较差(κ<0.40),且评价指标超出范围不可接受(肺炎克雷伯菌ME为4.2%,鲍曼不动杆菌mE为11.3%、ME为3.2%),提示对仪器法检测的上述两种细菌的替加环素药敏试验结果需谨慎解读,这一结论与文献报道一致[6,12]。

KB法操作简便、成本低廉,为临床使用最多的药敏试验方法之一。研究显示,替加环素理化性质活泼,KB法的药敏试验结果判定易受实验条件中的光照、氧气含量、实验时间等因素影响[8]。本研究通过比较常规KB法(KB2法)结果与BMD法,发现二者的一致性均不理想(大肠埃希菌κ=0.639,其他κ<0.400),除了大肠埃希菌的评价指标在可接受范围(阴沟肠杆菌的mE为20%,超出评价范围),其余细菌的评价指标均不可接受。本研究结果进一步印证了常规KB法不适合检测肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌对替加环素敏感性的结论[6,11-12]。另外,本研究还采用了在常规KB法的基础上滴加替加环素复敏液,即KB1法检测细菌对替加环素的敏感性,复敏液为EDTA溶液,本身无抑菌作用,但可以消除替加环素抗菌活性的影响因素,恢复药物的抗菌活性[8]。KB1法的药敏试验结果与BMD法表现出较好的一致性(κ>0.750),评价指标均在可接受范围,除鲍曼不动杆菌的中介率比较差异有统计学意义(P=0.027)外,其余结果均与BMD法比较差异均无统计学意义(P>0.05),KB1法检测肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌敏感株对替加环素的药敏试验结果明显优于KB2法。对于鲍曼不动杆菌,KB1法的mE(9.7%)接近可接受范围的上限,可能与此方法检测该菌的中介率明显增高有关(与BMD法比较差异有统计学意义),因此,当KB1法检测到鲍曼不动杆菌中介株时,需通过定量检测法再次确认。需要指出的是,本研究中阴沟肠杆菌菌株数量太少,需收集大样本量的菌株进一步证实KB1法是否适用于其对替加环素的药敏试验检测。

综上所述,对于耐碳青霉烯革兰阴性杆菌,仪器法和KB1法可以常规检测大肠埃希菌对替加环素的敏感性;而对于肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌,可以用KB1法检测其对替加环素的敏感性;当KB1法在检测鲍曼不动杆菌中介株时需谨慎对待,可通过简便有效的E-test法进行复检。