基于P 物质的二冬二母二草汤止咳作用及机制研究

李惠惠 袁维蔚 陈奕涛 陈洪

二冬二母二草汤是广东省名中医陈洪教授根据自身临床经验, 结合名医施金墨“对药”思想所创, 由麦冬、天冬、浙贝母、知母、甘草、鱼腥草组成, 具有清金润肺、甘凉养阴的功效, 主治肺阴亏虚型咳嗽, 症见干咳、痰中带血丝、痰少黏白、咳声短促, 或有盗汗、颧红、午后潮热、声音嘶哑、口干咽燥, 临床上多用于感染后咳嗽、慢性阻塞性肺疾病、肺结核等疾病见上述症状者。本课题组于前期研究中发现二冬二母二草汤具有良好的止咳效果［1,2］, P 物质(substance P, SP)在咳嗽反射中的作用已经非常明确［3］, 据此, 本研究拟基于SP 对二冬二母二草汤的止咳作用及机制进行探讨, 以期为该方的临床应用提供一定的实验理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物 本研究所有的动物实验操作均参照惠州市中医医院实验动物委员会规定的相关文件进行, 已获得惠州市中医医院实验动物伦理委员会批准。KM小鼠,体重20±2 g, 雌雄各半；英国种豚鼠, 体重250±50 g,雌雄兼用。实验动物均由广东省医学实验动物中心提供, 实验单位生产许可证编号：SCXK(粤)2018-0002,实验单位使用许可证编号：SYXK(粤)2018-0002。

1.2 药物 二冬二母二草汤(麦冬15 g、天冬15 g、浙贝母15 g、知母20 g、甘草6 g、鱼腥草15 g), 由惠州市中医医院中药房提供。磷酸可待因由国药集团工业股份有限公司提供, 批号20190601, 规格：30 mg/片。

1.3 试剂 氨水(广州上品化工有限公司)；枸橼酸(上海杭涌环保科技有限公司)；辣椒素(Sigma)；豚鼠SP试剂盒(美国R＆D 公司)。

1.4 仪器 VARIOS-KAN 酶标仪(广州吉源生物科技有限公司)。980-A 型超声雾化器(上海沫锦医疗器械有限公司)。

1.5 方法

1.5.1 二冬二母二草汤对氨水引咳小鼠咳嗽的影响取50 只KM 小鼠, 随机分为五组, 分别为空白对照组(蒸馏水)、磷酸可待因组(10 ml/kg)、二冬二母二草汤高剂量组(14.2 g 生药/kg)、二冬二母二草汤正常剂量组(7.1 g 生药/kg)、二冬二母二草汤低剂量组(3.55 g生药/kg)。采用灌胃方式对各组小鼠进行给药, 给药1 次/d、连续3 d, 容积为10 ml/kg。末次给药30 min后, 在100 mg 灭菌棉球中注入使用1 ml 注射器抽取的0.5 ml 氨水, 在倒置的1 L 玻璃烧杯内将棉球与小鼠一起置入, 以小鼠张嘴、腹肌剧烈收缩为咳嗽界定标准,记录小鼠咳嗽潜伏期及2 min 内咳嗽次数。

1.5.2 二冬二母二草汤对枸橼酸引咳豚鼠咳嗽的影响实验前1 d 在4 L 密闭玻璃钟罩内将豚鼠置入, 预先配置好17.5%枸橼酸, 使用980-A 型超声雾化器以最大喷雾量喷入10 s, 以听到咳嗽声为界定标准, 记录豚鼠5 min 内咳嗽次数, 筛选咳嗽次数大于10 次者为合格豚鼠用于实验。取35 只合格豚鼠随机分为五组, 分别为空白对照组(蒸馏水)、磷酸可待因组(10 ml/kg)、二冬二母二草汤高剂量组(14.2 g 生药/kg)、二冬二母二草汤正常剂量组(7.1 g 生药/kg)、二冬二母二草汤低剂量组(3.55 g 生药/kg)。采用灌胃方式对各组豚鼠进行给药, 给药1 次/d、连续5 d, 容积为10 ml/kg。末次给药30 min 后, 在4 L 密闭玻璃钟罩内将豚鼠置入, 预先配置好17.5%枸橼酸, 使用980-A 型超声雾化器以最大喷雾量喷入10 s, 记录豚鼠咳嗽潜伏期及5 min 内咳嗽次数。

1.5.3 二冬二母二草汤对辣椒素引咳豚鼠咳嗽次数的影响 实验前1 d 在4 L 密闭玻璃钟罩内将豚鼠置入,预先配置好30 μmol 辣椒素, 使用980-A 型超声雾化器以0.7 ml/min 喷雾量持续喷雾40 s, 豚鼠的咳嗽声响亮,以听到咳嗽声为界定标准, 记录豚鼠5 min 内咳嗽次数, 筛选咳嗽次数>10 次者为合格豚鼠用于实验。取40 只合格豚鼠随机分为五组, 分别为空白对照组(蒸馏水)、磷酸可待因组(10 ml/kg)、二冬二母二草汤高剂量组(14.2 g 生药/kg)、二冬二母二草汤正常剂量组(7.1 g生药/kg)、二冬二母二草汤低剂量组(3.55 g 生药/kg)。采用灌胃方式对各组豚鼠进行给药, 给药1 次/d、连续5 d, 容积为10 ml/kg。末次给药30 min 后, 在4 L 密闭玻璃钟罩内将豚鼠置入, 预先配置好30 μmol辣椒素,使用980-A 型超声雾化器以0.7 ml/min 喷雾量持续喷雾40 s, 记录豚鼠5 min 内咳嗽次数。

1.5.4 二冬二母二草汤对辣椒素引咳豚鼠血清SP 含量的影响 完成1.5.3 实验后, 增设6 只同批次模型对照组(蒸馏水), 再随机抽取1.5.3 实验中各组的豚鼠6 只, 取股动脉血, 在室温状态将血液自然凝固10～20 min 后离心(20 min, 转速2500 r/min)。使用酶标仪以450 nm 波长, 按试剂盒说明书操作步骤, 测定离心后上清液的分光光度值, 并根据标准曲线计算豚鼠血清SP 含量。

1.5.5 二冬二母二草汤对辣椒素引咳豚鼠支气管肺泡灌洗液中SP 含量的影响 完成1.5.4 实验后, 立即使用12 号钝针头抽取4 ml 冰蒸馏水进行支气管肺泡灌洗, 反复灌洗3 次, 收集灌洗液后离心(20 min,转速2500 r/min)。使用酶标仪以450 nm 波长, 按试剂盒说明书操作步骤, 测定离心后上清液的分光光度值, 并根据标准曲线计算豚鼠支气管肺泡灌洗液中SP含量。

1.6 统计学方法 采用SPSS19.0 统计学软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示, 不符合正态分布的采用非参数检验；符合正态分布的采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)。P<0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 二冬二母二草汤对氨水引咳小鼠咳嗽潜伏期、2 min 内咳嗽次数的影响 磷酸可待因组、二冬二母二草汤高剂量组、二冬二母二草汤正常剂量组、二冬二母二草汤低剂量组氨水引咳小鼠的咳嗽潜伏期均长于空白对照组, 2 min 内咳嗽次数均少于空白对照组, 差异具有统计学意义 (P<0.01)。见表1。

表1 二冬二母二草汤对氨水引咳小鼠咳嗽潜伏期、2 min 内咳嗽次数的影响( ±s)

表1 二冬二母二草汤对氨水引咳小鼠咳嗽潜伏期、2 min 内咳嗽次数的影响( ±s)

注：与空白对照组比较, aP<0.01

组别 鼠数(只) 剂量 咳嗽潜伏期(s) 2 min 内咳嗽次数(次)空白对照组组 10 18.94±5.77 48.52±8.96磷酸可待因组 10 10 ml/kg 59.97±13.38a 13.75±5.94a二冬二母二草汤高剂量组 10 14.2 g 生药/kg 40.42±16.32a 20.31±5.01a二冬二母二草汤正常剂量组 10 7.1 g 生药/kg 74.53±18.03a 14.03±4.07a二冬二母二草汤低剂量组 10 3.55 g 生药/kg 52.04±24.95a 21.02±9.99a

2.2 二冬二母二草汤对枸橼酸引咳豚鼠咳嗽潜伏期、5 min 内咳嗽次数的影响 二冬二母二草汤高剂量组、二冬二母二草汤低剂量组枸橼酸引咳豚鼠的咳嗽潜伏期均长于空白对照组, 差异具有统计学意义 (P<0.01)；磷酸可待因组、二冬二母二草汤正常剂量组枸橼酸引咳豚鼠的咳嗽潜伏期与空白对照组比较, 差异无统计学意义(P>0.05)。磷酸可待因组、二冬二母二草汤高剂量组、二冬二母二草汤正常剂量组、二冬二母二草汤低剂量组枸橼酸引咳豚鼠的5 min 内咳嗽次数均少于空白对照组, 差异具有统计学意义 (P<0.05 或<0.01)。见表2。

表2 二冬二母二草汤对枸橼酸引咳豚鼠咳嗽潜伏期、5 min 内咳嗽次数的影响( ±s)

表2 二冬二母二草汤对枸橼酸引咳豚鼠咳嗽潜伏期、5 min 内咳嗽次数的影响( ±s)

注：与空白对照组比较, aP<0.05, bP<0.01

组别 鼠数(只) 剂量 咳嗽潜伏期(s) 5 min 内咳嗽次数(次)空白对照组 7 15.97±5.84 29.89±5.04磷酸可待因组 7 10 ml/kg 25.83±11.72 16.08±11.15a二冬二母二草汤高剂量组 7 14.2 g 生药/kg 77.41±22.05b 18.27±10.82a二冬二母二草汤正常剂量组 7 7.1 g 生药/kg 23.06±8.53 8.00±5.17b二冬二母二草汤低剂量组 7 3.55 g 生药/kg 62.63±15.63b 17.08±10.99a

2.3 二冬二母二草汤对辣椒素引咳豚鼠5 min 内咳嗽次数的影响 磷酸可待因组、二冬二母二草汤高剂量组、二冬二母二草汤正常剂量组、二冬二母二草汤低剂量组辣椒素引咳豚鼠的5 min 内咳嗽次数均少于空白对照组, 差异具有统计学意义 (P<0.01)。见表3。

表3 二冬二母二草汤对辣椒素引咳豚鼠5 min 内咳嗽次数的影响( ±s, 次)

表3 二冬二母二草汤对辣椒素引咳豚鼠5 min 内咳嗽次数的影响( ±s, 次)

注：与空白对照组比较, aP<0.01

组别 鼠数(只) 剂量 5 min 内咳嗽次数空白对照组 8 21.94±4.89磷酸可待因组 8 10 ml/kg 9.13±3.07a二冬二母二草汤高剂量组 8 14.2 g 生药/kg 14.88±3.94a二冬二母二草汤正常剂量组 8 7.1 g 生药/kg 8.14±2.96a二冬二母二草汤低剂量组 8 3.55 g 生药/kg 12.13±3.95a

2.4 二冬二母二草汤对辣椒素引咳豚鼠血清/支气管肺泡灌洗液中SP 含量的影响 空白对照组辣椒素引咳豚鼠血清及支气管肺泡灌洗液中SP 含量高于模型对照组, 差异具有统计学意义 (P<0.05) ；磷酸可待因组、二冬二母二草汤高剂量组、二冬二母二草汤正常剂量组、二冬二母二草汤低剂量组辣椒素引咳豚鼠血清SP含量低于空白对照组, 差异具有统计学意义 (P<0.05 或<0.01)；二冬二母二草汤正常剂量组、二冬二母二草汤低剂量组辣椒素引咳豚鼠支气管肺泡灌洗液中SP 含量低于空白对照组, 差异具有统计学意义 (P<0.05)；磷酸可待因组、二冬二母二草汤高剂量组辣椒素引咳豚鼠支气管肺泡灌洗液中SP 含量与空白对照组比较, 差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 二冬二母二草汤对辣椒素引咳豚鼠血清/支气管肺泡灌洗液中SP 含量的影响( ±s, ng/L)

表4 二冬二母二草汤对辣椒素引咳豚鼠血清/支气管肺泡灌洗液中SP 含量的影响( ±s, ng/L)

注：与空白对照组比较, aP<0.05, bP<0.01

组别 鼠数(只) 剂量 血清SP 含量 支气管肺泡灌洗液中SP 含量模型对照组 6 106.87±15.76a 121.76±14.99a空白对照组 6 129.85±16.90 147.48±20.05磷酸可待因组 6 10 ml/kg 106.93±14.17a 131.63±27.13二冬二母二草汤高剂量组 6 14.2 g 生药/kg 103.94±10.01b 129.85±9.90二冬二母二草汤正常剂量组 6 7.1 g 生药/kg 102.83±14.12a 119.97±11.88a二冬二母二草汤低剂量组 6 3.55 g 生药/kg 108.68±15.04a 119.97±15.05a

3 讨论

Von Euler 和Gaddum 等于1931 年在马的肠和脑提取物中寻找乙酰胆碱同时发现了SP, 它的化学和生物学特性均较为特殊［4］。SP 是一种神经肽, 属于速激肽家族［5,6］。SP 的合成主要在脊髓背根神经节, 于外周和中枢神经系统中广泛分布, 且多存在于无髓鞘的C 类纤维内, 向下移行至感觉神经的神经末梢, 向上移行至脊髓后角［7-10］。SP 由神经元胞体合成转运, 在感觉神经(C 类纤维)末梢中, 当受到枸橼酸、辣椒素、感染、吸烟、干燥寒冷气体、高渗盐水、变应原、缓激肽、组胺、臭氧等各种理化刺激时, 可反过来再刺激C 类纤维, 逆向释放进入局部组织中。SP 的释放可引起气管和支气管分泌功能亢进, 血管通透性增加, 咳反射阈值下降, 支气管收缩等, 从而导致咳嗽的产生［11-13］。

本研究结果显示：二冬二母二草汤高剂量组(14.2 g 生药/kg)、正常剂量组(7.1 g 生药/kg)、低剂量组(3.55 g 生药/kg)对氨水引咳小鼠、枸橼酸引咳豚鼠、辣椒素引咳豚鼠三种咳嗽模型均有不同程度的止咳作用；二冬二母二草汤高剂量组、正常剂量组、低剂量组均能显著降低辣椒素引咳豚鼠血清SP 含量, 二冬二母二草汤正常剂量组、二冬二母二草汤低剂量组均能显著降低辣椒素引咳豚鼠支气管肺泡灌洗液中SP 含量, 提示该方的止咳作用机制可能与抑制SP 含量有关。