超声波辅助复合酶法提取茶树菇多糖工艺优化

李佳虹，赵俊益，杜昕,2*，陈嫒

（1.成都师范学院 化学与生命科学学院，四川成都 611130；2.成都师范学院食品发酵研究所，四川成都 611130）

茶树菇（Agrocybe cylindracea）也称茶薪菇，属于担子菌门和田头菇属（Agrocybe）。干燥后的茶树菇可以治疗头痛、呕吐和老年人哮喘等，对肾虚、癌症、高血压有很好的辅助治疗功效[1]。茶树菇多糖具有很强的体外抗氧化特性，是一种超氧自由基捕捉剂[2-3]，同时也可以作为免疫调节剂，具有抗肿瘤、降血糖等作用[4]。

传统的多糖类提取方法有热水提取法[5]、酸碱提取法[6]等，但均存在耗时长、提取率低、成本高等问题。而超声波辅助法提取多糖具有效率高、操作简便快速等优点，已被广泛使用[7]。例如，张君等[8]使用超声波提取多糖，提取率为16.7%，与热水浸提法相比，该法的提取率明显提高。樊伟伟等[9]使用超声波浸提猴头菇多糖，提取率为6.22%，是热水浸提法提取多糖得率的1.45 倍。另外，酶提法液是一种简单、便捷、绿色无污染的处理方法。谢玮等[10]利用纤维素酶和果胶酶提取黑松松针多糖，发现复合酶法优于单酶提取法，复合酶法的最大提取率为6.17%。王莹等[11]同样使用这两种酶辅助提取柚子皮多糖，最高提取率为8.26%。与水提醇沉法及纤维素酶辅助法相比，复合酶法的提取效率显著提高。

为进一步提高多糖提取效率，学者们利用超声波辅助酶催化水解，并取得了一定成效[12]。廉宜君等[13]研究发现，在纤维素酶和果胶酶提取多糖中加上超声波的辅助，可以使提取效果达到最佳，最大提取率为12.35%。王振西[14]同样利用该法提取辣木多糖，获得超声协同复合酶的最大提取率为33.03%，比单独采用超声法提取多糖的得率高出近2 倍。基于此，本文通过添加纤维素酶和果胶酶，采用超声辅助复合酶法提取茶树菇多糖，并通过单因素实验和响应面实验优化茶树菇多糖提取工艺，以期为茶树菇多糖在食品工业中的应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜茶树菇，购于温江大润发超市；葡萄糖、硫酸、苯酚、95%乙醇、80%乙醇，分析纯，天津市化学试剂有限公司；纤维素酶（100 000 U/g），食品添加剂，宁夏和氏璧生物技术有限公司；果胶酶（酶活力≥500 000 U/g），生化试剂，成都科龙化工试剂厂。

1.2 仪器和设备

KQ-250DE 型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；ME204E 电子天平（万分之一），广州广电计量检测股份有限公司；XL-30C 型超微粉碎机，南京威利朗食品机械有限公司；HWS28 型电热恒温水浴锅，欧莱博科学仪器有限公司；LD5-2B 低速离心机，北京京立离心机有限公司；GM-1.0A 隔膜真空泵，天津津腾实验设备有限公司；UV-1100 型紫外可见分光光度计，欧莱博科学仪器有限公司；MIX2000漩涡振荡器，杭州睿城仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 原料预处理

将新鲜茶树菇置于烘箱中，60 ℃，烘12 h；取干茶树菇子实体样品剪碎，粉碎机粉碎，过80 目筛备用。

1.3.2 茶树菇多糖的提取

参考陈巧玲等[15]的研究方法并进行适当修改。称取1 g干茶树菇粉，按一定的料液比加入适量蒸馏水，超声波（680 W）处理一定时间后，50 ℃水浴0.5 h。称取一定量的果胶酶和纤维素酶，按酶底比1.5%加入食用菌溶液中，反应1 h 后抽滤（微孔过滤膜水系0.45 μm），滤液于沸水中灭酶10 min。用水将上述滤液转移至圆底烧瓶，加入50 mL 蒸馏水，装上磨口的空气冷凝管，于沸水浴中提取2 h，冷却至室温，将溶液转移至100 mL 容量瓶中，加水定容，得到样品测定液，采用苯酚-硫酸法测定多糖总量。

1.3.3 单因素实验

选取果胶酶∶纤维素酶质量比（1.0 ∶1.0、1.5 ∶1.0、2.0 ∶1.0、2.5 ∶1.0 和3.0 ∶1.0）、超声时间（20 min、25 min、30 min、35 min 和40 min）、料液比（1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25 和1 ∶30，g ∶mL）3 个因素进行单因素实验，以多糖提取率为考察指标，探究各因素对茶树菇多糖提取效果的影响。研究某一因素时，其他因素的控制量为料液比1 ∶20（g ∶mL）、果胶酶和纤维素酶（质量比，2.0 ∶1.0）、超声时间20 min。

1.3.4 响应面优化实验

在单因素实验的基础上进行响应面优化实验。使用Design-Expert 软件进行响应面实验设计，如表1 所示。

表1 响应面优化因素水平表

1.4 多糖含量测定

1.4.1 试剂、溶液配制

苯酚试剂的配制：称取80 g 苯酚于100 mL 烧杯中，加水溶解，定容至100 mL 后转移至棕色瓶中，置于4 ℃冰箱中避光储存。吸取5 mL 80%苯酚溶液，溶于75 mL 水中，混匀，现配现用。

葡萄糖标准溶液（100 mg/L）的配制：称取0.100 0 g干燥恒重的葡萄糖于100 mL 烧杯中，加水溶解，定容至1 000 mL，于4 ℃冰箱中储存。

1.4.2 标准曲线绘制

分别吸取0.0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL的标准葡萄糖工作溶液置于20 mL具塞玻璃试管中，用蒸馏水补至1.0 mL。向试液中加入1.0 mL苯酚溶液，然后快速加入5 mL 硫酸，静置10 min，使用漩涡振荡器使反应液充分混合，然后将试管置于30 ℃水浴中反应20 min，于490 nm 处测定吸光度，以葡萄糖质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。得到的线性回归方程为y=0.004 9x-0.002 4，R2=0.998 5。

1.5 多糖提取率计算

多糖提取率按公式（1）计算。

式中：c为茶树菇多糖的质量浓度，mg/mL；V为提取液的体积，mL；N为多糖溶液的稀释倍数；W为茶树菇粉末质量，g。

1.6 数据处理及分析

采用SPSS 22.0 软件对数据进行方差分析，采用Design-Expert 11.0 软件进行响应面分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 复合酶比对茶树菇多糖提取率的影响

如图1 所示，随着果胶酶添加量的增大，多糖提取率呈先增大后减小的趋势。当复合酶比为1.5∶1.0，多糖提取率达到峰值，酶解催化效率已达最大，随后提取率逐渐趋于稳定。

图1 复合酶比对多糖提取率的影响

2.1.2 超声时间对多糖提取率的影响

由图2 可知，随着超声时间的延长，茶树菇多糖提取率呈先增大后减少的趋势，当超声时间为30 min时，茶树菇的多糖提取率最高。可能是因为超声波对茶树菇的细胞膜破坏作用有限，短时间的超声作用不能使胞内物质释放，因此多糖提取率较低。随着超声时间的延长，细胞膜被破坏的程度增大，使多糖提取率上升。但当超声时间超过30 min 时，超声时间过长，超声波的机械剪切和热作用使多糖被破坏与分解，导致多糖提取率减小[16]。由此可得最佳超声时间为30 min。

2.1.3 料液比对多糖提取效果的影响

由图3 可知，随着提取液用量的增大，茶树菇多糖提取率呈先增大后基本稳定的趋势。当料液比在1 ∶10 到1 ∶25 之间时，随着提取液用量的增大，多糖提取率大幅增加。在料液比为1 ∶25 时多糖提取率达到峰值，可能是因为多糖在料液比为1 ∶25时已经全部溶解出来，而过量加入提取液可能会导致茶树菇粉在超声时所吸收的超声波减少，从而导致多糖溶解不充分。

图3 料液比对多糖提取率的影响

2.2 响应面法优化实验结果

2.2.1 响应面实验设计与结果

基于单因素实验结果，以复合酶、超声时间、料液比3 个因素为自变量，以多糖提取率为响应值，进行17 次实验，实验结果如表2 所示。

表2 响应面实验设计与结果

2.2.2 回归方程方差分析及显著性检验

为了检验回归方程的有效性以及各种因素对多糖提取率的影响，对数据的回归方程进行方差分析，结果见表3。采用Design-Expert 8 软件进行回归拟合，得到拟合回归方程为Y=24.30+0.061A-0.04B-0.19C-0.015AB+0.098AC-2.5×10-3BC-0.31A2-0.60B2-0.27C2。

表3 实验结果方差分析表

从表3 可以看出，模型P＜0.001，失拟项P=0.1771 ＞0.05，影响不显著。回归模型的相关系数R2为0.993 2，修正后的相关系数R2Adj为0.984 5，说明模型拟合度良好，预测值与实测值相关性好，实验误差小。因此，本文建立的茶树菇多糖提取率的回归模型可用于分析和预测茶树菇多糖的提取率。如表3所示，一次项C、交互项AC和二次项A2、B2、C2对多糖提取率影响极显著，一次项A、B对多糖提取率影响显著，其他因素的影响不显著。

2.2.3 响应面影响因素的交互作用

由上文可知，AC对多糖提取率的影响显著，引文本实验选择AC进一步进行交互作用分析，料液比与超声时间的交互作用的响应面如图4 所示。随着超声时间和提取液用量的增加，多糖提取率呈先增加后降低的趋势，并出现了爬坡最高点，结合底部的二维等高线图可知，多糖的提取率具有最高点，料液比和超声时间的交互作用显著。

图4 AC 交互作用

2.2.4 最佳工艺参数确定及验证性实验

经过模型预测，多糖的最佳提取条件为料液比为1 ∶29（g ∶mL）、复合酶比为1.5 ∶1.0、超声时间为29 min，多糖提取率为24.14%。在该条件下进行了3 组平行实验，实验结果见表4。3 组验证实验中多糖提取率的平均值为24.128%，与回归方程所得的预测值相近，在误差许可的范围内。此外，该条件下的多糖提取率约为对照组的1.5 倍，说明超声波辅助复合酶对于茶树菇多糖率的提取效果显著。

表4 验证及对照实验结果

3 结论

本文采用超声波辅助复合酶法优化提取茶树菇多糖工艺条件，结果表明最佳提取工艺条件为料液比1 ∶29（g ∶mL）、复合酶比1.5 ∶1.0、超声波时间29 min，该条件下茶树菇多糖的提取率为24.128%，约为对照组的1.5 倍，表明超声波辅助纤维素酶及果胶酶对茶树菇多糖提取率的影响显著。本研究结果可为茶树菇多糖产业发展提供一定的理论基础及参考。