基于SPRi 技术和分子对接探析人参皂苷与MAPK 信号通路的相互作用

张骆琪，李 森，崔如意，杜 霞，5，陈 鸿，王 猛，许海玉*

（1.中国中医科学院中药研究所，北京 100700；2.中国科学院遗传与发育生物学研究所，北京 100101；3.吉林农业大学中药材学院，吉林 长春 130118；4.中国中医科学院医学实验中心，北京 100700；5.陕西省中医药研究院，陕西 西安 710003）

癌症是由基因突变引起不受调节的细胞过度增殖的疾病，是全球第二大死亡原因。2012 年全球新发癌症病例为1 410 万例，预计在2030 年癌症发病高达2 170 万例［1］。抑制癌症发展，减少高发病率的重要策略之一是靶向癌症的药物。癌症的发生、发展与细胞增殖、凋亡等途径密切相关。因此，细胞周期调控因子和凋亡刺激因子是开发潜在抗癌药物的重要靶点。

MAPK 通路（RAS-RAF-MEK-ERK） 是关键的细胞内信号通路，参与调节细胞增殖、细胞周期、细胞存活、血管生成、细胞迁移等过程［2-3］。通过抑制MAPK 通路的异常激活，会减少癌细胞增殖、侵袭能力及生长，促进癌细胞凋亡［4-5］。目前临床上针对作用于MAPK 通路针对癌症的抑制剂基本上是化学合成药物，例如vemurafenib、dabrafenib、trametinib 等［6］。价格昂贵、不良反应大、且容易产生耐药性。

人参皂苷是一种固醇类天然产物，是人参、西洋参、三七等人参属药材的主要活性成分［7-8］。研究表明，人参等药材在抗癌作用显著，且减轻化疗、放疗的不良反应，提高患者的生活质量［8-9］。对其活性成分人参皂苷的作用机制进行研究迫在眉睫。

人参皂苷种类繁多，作用靶点广，实验验证药效周期长，消耗经费巨大。通过分子对接技术预测活性成分-蛋白相互作用，分析构效关系［10］。结合SPRi 技术高通量筛选，分析分子相互作用［11］。能够快速筛选出最有希望的小分子进行实验。

因此本研究运用分子对接技术研究人参皂苷与MAPK通路相互作用的潜在机制，构建“成分-靶点蛋白” 网络模型，利用SPRi 技术筛选与核心靶点ERK1 结合的人参皂苷类成分，并进一步通过分子对接技术确定其结合位点。

1 材料

1.1 仪器 PCR 扩增仪 （北京东胜科技有限公司）；Superdex 200 increase 分子筛（美国GE Healthcare 公司）；Kx5 Sinstrument SPRi 仪（美国Plexera 公司）。

1.2 试剂 ginsenoside Rb1、ginsenoside Rb2、ginsenoside Rg1、ginsenoside Rg3、ginsenoside Rc、ginsenoside Re、ginsenoside Rd 等27 个小分子（成都曼思特生物科技有限公司）；限制性核酸内切酶AscI、NotI、T4 DNA Ligase （美国NEB 公司）；Trans-T1 感受态细胞、BL21 （DE3） 感受态细胞、pET-24-2-his 质粒（北京全式金生物技术有限公司）。引物合成及测序由北京擎科生物科技股份有限公司完成。

2 方法

2.1 分子对接

2.1.1 小分子准备 小分子结构来源于PubChem 数据库（https：／／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／） 和ECTM 数据库（http：／／www.tcmip.cn／ETCM／index.php／Home／Index／），使用Chem3D 19.0 软件构建小分子3D 结构的MOL2 格式文件，并将MOL2 格式文件转化为AutoDock Vina 分子对接（http：／／vina.scripps.edu／） 可识别的PDBQT 格式文件。

2.1.2 靶点蛋白准备 通过KEGG 数据库及相关文献收集ERK 通路的相关蛋白［12］，从RCSB PDB 数据库 （www.rcsb.org） 获得ERK 通路中关键蛋白的晶体结构。AutoDock 软件对蛋白结构进行优化，添加缺失氢原子，减去多余水分子。

2.1.3 确定活性口袋及分子对接步骤 根据文献报道以及PyMOL 1.8.6 软件插件GetBox Plugin 确定蛋白分子的活性口袋（表1）。AutoDock Vina 和Python 脚本进行高通量分子对接。以结合能作为评价函数，分析小分子与蛋白的最佳结合方式。PyMOL 可视化小分子和蛋白结合模式，并分析关键结合位点。

表1 靶点蛋白活性口袋

2.1.4 人参皂苷与蛋白作用网络的构建 采用Cytoscape 3.7.2 软件构建人参皂苷与靶点蛋白互作的网络模型。

2.2 制备ERK1 蛋白

从表1可以看出，广西金融术语的翻译过于放在字面的翻译，而忽略了实际的意义体现。但是，纵观后期的金融翻译，广西金融翻译也出现了采用香港金融翻译的现象。[4]

2.2.1 构建原核表达载体 根据NCBI 收录的人ERK1 基因的CDS 序列和原核表达质粒（pET-24-2-his） 酶切位点设计引物，利用高保真DNA 聚合酶进行PCR 扩增，获得带有酶切位点的ERK1 基因CDS 序列，用AscI、NotI 限制性内切酶对PCR 产物和质粒在37 ℃、90 min 条件下进行酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，并纯化回收；纯化回收的ERK1 片段和质粒片段在16 ℃下通过T4 DNA 连接酶连接120 min；连接产物通过热激法转入Trans-T1 感受态细胞内，37 ℃培养12～16 h，挑选单菌落，并进行菌液PCR 筛选阳性克隆，测序验证。选取序列完全正确的菌液进行质粒提取，提取后的质粒通过热激法转入原核表达细菌BL21（DE3） 中，选取阳性克隆进行后续蛋白表达。

2.2.2 重组蛋白诱导表达 重组质粒转化菌在含Kan 抗性的LB 培养液中进行培养，当菌液OD600nm为0.6～0.8 时，调整温度为17 ℃，加入IPTG 终浓度为0.4 mmol／L，诱导蛋白表达16 h。在4 ℃下4 500 r／min 离心10 min，收集菌体。每1 g 菌体中加入5 mL 破菌buffer （50 μL 蛋白酶抑制剂、50 μL 10 mg／mL 溶菌酶、25 μL DNaseI），混匀，冰浴30 min。使用高压细胞破碎仪，在4 ℃下破碎4 次。在4 ℃下12 000 r／min 离心40 min，收集上清与沉淀。

2.2.3 蛋白纯化 用镍柱粗纯化，将提取的粗蛋白上清与平衡好的beads，4 ℃结合60 min。15 mmol／L 咪唑洗脱，待洗脱液与G250 考马斯亮蓝溶液反应不发生颜色变化时，则停止用该梯度咪唑溶液洗脱。通过相同步骤，依次用50、100、150、250 mmol／L 咪唑洗脱，收集洗脱液。

利用superdex 200 increase 分子筛柱纯化蛋白。吸取样品进入进样环；pump path 改为inject，洗脱2 mL 时，将pump path 改为load，25 mL 洗脱。体积流量0.4 mL／min；压力2 MPa。根据蛋白峰图，收集样品。通过SDS-PAGE 法鉴定纯化的蛋白为单一条带，见图1。

2.3 SPRi 分析小分子与ERK1 蛋白的相互作用 参照Plexera 相关标准流程，通过SPRi 分析仪分析ERK1 和人参皂苷的相互作用。人参皂苷均用DMSO 配制浓度为20 mmol／L 的母液，ERK1 蛋白母液用含有150 mmol／L NaCl 的50 mmol／L Tris-HCl （pH＝8.0） 缓冲溶液分别稀释为0.5、1.0、5.0 μmol／L。选择3D UVC 芯片，将5 mg／mL 人参皂苷种植于芯片表面，点样湿度＜45%，温度20 ℃，真空干燥，进行光交联反应。

3 结果

3.1 分子对接 通过AutoDock Vina 进行分子对接，分析27 种人参皂苷与靶点蛋白的相互作用，以Binding Energy 作为考察小分子配体与蛋白受体结合的指标，结合能小于-1.2 kcal／mol或者小于-5 kJ／mol，则认为小分子与蛋白可以结合。选择结合能最低、小分子结构最舒展的结合构象作为分子对接的结果，人参皂苷与靶点蛋白结合能汇总见表2。

表2 人参皂苷与靶点蛋白对接的结合能

筛选结合能小于-1.2 kcal／mol 的小分子-靶点蛋白绘制人参皂苷-靶点蛋白网络，见图2。由此可知，人参皂苷与MAPK 信号通路的相互作用存在1 个化合物作用于多靶点，也有多个化合物调控1 个靶点的情况，这体现了中药多成分、多靶点协同调控的特点。

图2 人参皂苷-MAPK 通路蛋白靶点网络

通过结合能高低分析这27 种人参皂苷成分与MAPK 信号通路上靶点蛋白的结合，发现27 种人参皂苷中，有21种人参皂苷成分与ERK1 的结合能低，例如ginsenoside Rh2、ginsenoside Rb3、ginsenoside CK 等。因此，选择通过SPRi 实验对这21 种人参皂苷与ERK1 靶点蛋白的结合作用进行研究。

图3 SPRi 检测ERK1 蛋白与7 种人参皂苷的结合能力

表3 ERK1 蛋白与7 种人参皂苷结合的动力学、亲和力参数

3.3 人参皂苷人参皂苷与ERK1 蛋白结合可视化 基于SPRi 结合结果，通过PyMOL 软件对 （20R）-ginsenoside Rg3、ginsenoside Rc、pseudoginsenoside Rh2 等7 种人参皂苷与ERK1 蛋白的分子对接进行可视化，见图4，并对人参皂苷与蛋白的结合作用进一步分析，发现人参皂苷与ERK1结合的主要位点是Lys71、Glu88、Asp184。人参皂苷与ERK1 蛋白分子对接能和结合位点汇总结果见表4。

图4 人参皂苷与ERK1 蛋白分子对接图

表4 人参皂苷与ERK1 蛋白分子对接能和结合位点

4 讨论

随着科技的进步，癌症的治疗手段多种多样，包括化疗、手术、放疗等等，但癌症愈后差、复发概率高、死亡率高，靶向抑制剂为癌症的治疗提供了更多的选择。已经有多项研究表明MAPK 通路在各种癌症中的作用，针对MAPK 通路筛选靶向抑制剂的开发已经取得了令人鼓舞的成果。但这些抑制剂主要作用于是RAF （vemurafenib、dabrafenib、encorafenib） 和MEK （trametinib、binimetinib、cobimetinib），关于ERK 的抑制剂很少［13］。

ERK1 在MAPK 通路上处于独特位置，其上游分子RAF 除了MEK 外几乎没有其他效应子，而MEK 除了ERK没有其他底物；下游通路中，ERK 是唯一能够刺激多种下游底物的激活剂［14-16］。抑制ERK1 活性能够逆转上游突变引起的MAPK 通路的异常激活，靶向ERK1 抑制剂在MAPK 信号通路异常导致的癌症治疗中起重要作用。目前关于ERK1 的抑制剂处于不同的临床试验阶段，ulixertinib（BVD-523）、GDC-0994、ASN007 等，然而这些抑制剂的缺点也是显而易见的，它们的作用有限，抑制剂仅对少数特定的癌症类型有效，因此，筛选新型的ERK 抑制剂是很有价值的研发方向。

人参皂苷具有广泛的生物活性。本研究利用分子对接和SPRi 技术，挖掘分析人参皂苷调节MAPK 信号通路的关键成分和作用靶点。共筛选得到（20R）-ginsenoside Rg3、ginsenoside Rc、ginsenoside Rg1、pseudoginsenoside F11、panaxadiol、ginsenoside Rb2、pseudoginsenoside Rh2 等7 种成分，调节关键靶点ERK1。研究发现，人参能够缓解非小细胞肺癌患者的呕吐、腹泻等症状，提高白细胞、血小板数量等，增强化疗的效果、减少不良反应、提高免疫力等［17］。人参根总提取物能够在体内和体外抑制MAPK 信号通路激活自噬、减轻炎症［18］。Ginsenoside Rg1 能够抑制6-OHDA 诱导的ERK1／2 磷酸化［19］；ginsenoside Rb2 通过作用于Ras-ERK1／2 信号通路来保护骨髓间充质干细胞免受地塞米松诱导的细胞凋亡［20］。结合本实验结果，推测（20R）-ginsenoside Rg3、ginsenoside Rc、ginsenoside Rg1 等可能是人参等药材抗癌的重要活性成分之一，能够作用于ERK 蛋白靶点。

综上所述，本研究基于分子对接和SPRi 技术分析了人参皂苷与ERK 信号通路的相互作用，为人参皂苷机制研究及ERK1 蛋白抑制剂研究提供方向，也为中药体外筛选提供新思路。同时，体外和体内存在一定差异，需要分子实验、细胞实验和动物实验等进行分析验证。