通关藤化学成分及其细胞毒活性

贾祎萍，吴子薇，李晓波，王嘉祺，时晓颖，王梦月*，韩永龙

（1.上海交通大学药学院，上海 200240；2.上海交通大学医学院附属第六人民医院药剂科，上海 200233）

通关藤又名通关散、通光藤、乌骨藤、奶浆藤、通天散、龙爪草、下奶藤，为萝藦科植物通关藤Marsdeniatenacissima（Roxb.） Wight et Arn.的干燥藤茎，始载于《滇南本草》，历史悠久，其性微寒味苦，入肺经，具有止咳平喘、祛痰、通乳、清热解毒等功效，可治疗喘咳痰多、产后乳汁不通、风湿肿痛、疮痈等，应用广泛［1］。现代研究发现，通关藤具有抗炎、止咳、平喘、抗肿瘤等作用，可用于治疗气管炎、扁桃体炎、咽炎、膀胱炎、肺炎、哮喘、肿瘤，效果显著［2-3］。近年来，课题组发现，通关藤水煎液制剂——通关藤注射液具有增强紫杉醇抗乳腺癌作用［4］，通关藤C21甾体化合物能够逆转肿瘤细胞对紫杉醇的耐药性［5］。为系统阐明通关藤的抗肿瘤作用物质基础，本研究对通关藤水煎液化学成分进行研究，从中分离得到12 个化合物，其中，新化合物1 个，新天然产物1 个，部分化合物具有细胞毒活性。

1 材料

Bruker Avance 600 MHz 核磁共振仪 （德国Bruker 公司，配有13C／1H／15N TCI 超低温探头，TMS 为内标）；Agilent 1290 UPLC-Q-TOF 质谱联用仪、Agilent 1260 Infinity Ⅱ制备型高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；P-2000 型全自动数字旋光仪（日本分光株式会社）；YMC 色谱柱 （10 mm×250 mm，5 μm，日本YMC 公司）；EYELA N-101型旋转蒸发仪（日本东京理化器械株式会社）；DZF-6050 型真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；SK6200H 超声清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；WFH-203B 三用紫外分析仪（上海耀壮检测仪器设备有限公司）；Varioskan Flash 多功能酶标仪（美国Thermo 公司）。

D101 大孔吸附树脂（天津德力特环保科技有限公司）；柱层析用硅胶（200～300 目，青岛海洋化工有限公司）；HSGF254硅胶G 高效薄层色谱板（烟台江友硅胶开发有限公司）；ODS 反相硅胶（40～63 μm，德国Merck 公司）。乙腈（色谱纯，上海百灵威化学技术有限公司）；乙醇、甲醇、二氯甲烷（分析纯，上海泰坦科技股份有限公司）。

人肺癌细胞A549、人肝癌细胞Bel-7402 （中国科学院上海细胞库）。MTT、5-氟尿嘧啶（国药集团化学试剂公司）；RPMI 1640 培养基 （美国Thermo 公司）。

通关藤由南京圣和药业有限公司提供，经上海交通大学药学院王梦月副教授鉴定为萝藦科植物通关藤Marsdeniatenacissima（Roxb.） Wight et Arn.的干燥茎藤。凭证标本（MT202101） 保存于上海交通大学药学院。

2 提取与分离

取通关藤5 kg，加10 倍量水，煎煮3 次，每次1 h，过滤，滤液浓缩至2 L；加16 L 85%乙醇，搅匀，4 ℃放置24 h，过滤，滤液回收乙醇，浓缩至1.5 L；再加12 L 乙醇，4 ℃放置48 h，过滤，滤液回收乙醇，浓缩得浸膏1 L。

浸膏经大孔树脂柱，依次用水，30%、60%、90%乙醇梯度洗脱，90% 乙醇洗液减压回收溶剂，得醇提物（4.60 g）。醇提物经硅胶柱分离，以甲醇-二氯甲烷（0 ∶1～1 ∶4） 梯度洗脱，得Fr.A～Fr.B。Fr.A （0.3 g） 经制备HPLC 纯化，以甲醇-水（1 ∶1～1 ∶19） 梯度洗脱（检测波长210 nm），得Fr.A1～Fr.A3。Fr.A1 （32 mg） 经制备HPLC纯化，以乙腈-水（77 ∶23） 梯度洗脱（体积流量5 mL／min，检测波长254 nm），得化合物3 （tR＝11.98 min，2.37 mg）、4 （tR＝3.85 min，0.76 mg）。Fr.A2 （48 mg） 经制备HPLC 纯化，以乙腈-水 （7 ∶ 13～4 ∶ 1） 梯度洗脱 （体积流量4 mL／min，检测波长210 nm），得化合物1 （tR＝41.61 min，3.56 mg）、2 （tR＝30.78 min，5.63 mg）。Fr.A3 （52 mg） 经制备HPLC 纯化，以乙腈-水（2 ∶3） 洗脱（体积流量5 mL／min，检测波长254 nm），得化合物5 （tR＝6.65 min，8.4 mg）、6 （tR＝8.49 min，1.1 mg）。Fr.B （3.4 g） 经硅胶柱分离，以甲醇-二氯甲烷（1 ∶99～1 ∶4） 梯度洗脱，得Fr.B1～Fr.B4。Fr.B1 （231 mg） 经硅胶柱纯化，以甲醇-二氯甲烷（1 ∶19～3 ∶17） 梯度洗脱，得化合物7 （6.1 mg）。Fr.B2 （845 mg） 经硅胶柱纯化，以甲醇-二氯甲烷（1 ∶19～3 ∶17） 梯度洗脱，得化合物8 （11.4 mg）、9 （3.1 mg）、10（6.6 mg）。Fr.B3 （459 mg） 经ODS 柱纯化，以甲醇-水（2 ∶3～4 ∶1） 梯度洗脱，得化合物11（1.7 mg）、12 （4.0 mg）。

3 结构鉴定

图1 化合物1 结构式及主要相关信息Fig．1 Chemical structure and key correlations of compound 1

表1 化合物1 的1H-NMR、13C-NMR波谱数据Tab．1 1H-NMR and 13C-NMR spectroscopic data on compound 1

化合物2：白色粉末。1H-NMR （C5D5N，600 MHz）δ：1.31 （3H，d，J＝4.4 Hz，H-4'），1.39（3H，s，H-19），1.68 （3H，s，H-18），1.50（3H，s，H-21），3.84 （1H，m，H-3），4.85（1H，m，H-12α），4.86 （1H，m，H-11β），6.40（1H，d，J＝4.4 Hz，H-3'）；13C-NMR （C5D5N，150 MHz）δ：38.2 （C-1），31.5 （C-2），68.7（C-3），38.2 （C-4），44.8 （C-5），28.3 （C-6），35.7 （C-7），78.5 （C-8），58.3 （C-9），39.3（C-10），70.4 （C-11），73.4 （C-12），46.4 （C-13），80.6 （C-14），35.7 （C-15），34.4 （C-16），55.5 （C-17），17.2 （C-18），16.7 （C-19），99.9（C-20），24.5 （C-21），167.9 （C-1'），128.9（C-2'），138.4 （C-3'），12.1 （C-4'），14.1 （C-5'）。以上数据与文献［9］ 报道基本一致，故鉴定为12-O-惕各酰基-通关藤苷元A。

化合物3：棕色粉末。1H-NMR （C5D5N，600 MHz）δ：6.93 （1H，d，J＝2.0 Hz，H-2），6.81（1H，d，J＝8.0 Hz，H-5），6.80 （1H，dd，J＝8.0，2.0 Hz，H-6），3.81 （1H，d，J＝9.6 Hz，H-7），2.41 （1H，m，H-8），3.63 （1H，dd，J＝8.9，6.4 Hz，H-9a），4.19 （1H，t，J＝6.4 Hz，H-9b），3.77 （3H，s，3-OCH3），6.90 （1H，s，H-2'），7.15 （1H，s，H-5'），2.70 （1H，dd，J＝13.1，4.1 Hz，H-7'a），2.92 （1H，dd，J＝13.1，4.1 Hz，H-7'b），2.24 （1H，m，H-8'），3.53 （1H，dd，J＝8.9，6.4 Hz，H-9'a），3.99（1H，t，J＝6.4 Hz，H-9'b），3.56 （3H，s，4'-OCH3）；13C-NMR （C5D5N，150 MHz）δ：135.8（C-1），112.2 （C-2），147.9 （C-3），145.9 （C-4），115.5 （C-5），121.8 （C-6），49.0 （C-7），49.9 （C-8），72.3 （C-9），126.2 （C-1'），111.6（C-2'），147.2 （C-3'），146.4 （C-4'），116.4（C-5'），132.8 （C-6'），31.6 （C-7'），42.0 （C-8'），71.5 （C-9'），54.8 （3-OCH3），55.0 （3'-OCH3）。以上数据与文献 ［10］ 报道基本一致，故鉴定为isoshonanin。

化合物4：白色粉末。1H-NMR （C5D5N，600 MHz）δ：6.84 （2H，s，H-2，6），5.03 （1H，d，J＝6.3 Hz，H-7），3.41 （1H，m，H-8），4.60（1H，d，J＝8.6 Hz，H-9a），3.94 （1H，overlapped，H-9b），3.47 （1H，m，H-8'），4.10（1H，dd，J＝9.6，8.3 Hz，H-9'a），3.90 （1H，dd，overlapped，H-9' b），3.75 （6H，s，3，5-OCH3）；13C-NMR （C5D5N，150 MHz）δ：127.4（C-1），104.0 （C-2），149.1 （C-3），132.4 （C-4），149.1 （C-5），104.0 （C-6），84.5 （C-7），46.3 （C-8），71.0 （C-9），179.2 （C-7'），43.7（C-8'），68.4 （C-9'）。以上数据与文献［11］ 报道基本一致，故鉴定为caruilignan D。

化合物5：白色粉末。1H-NMR （C5D5N，600 MHz）δ：8.08 （1H，s，H-2），7.31 （1H，d，J＝8.2 Hz，H-5），8.17 （1H，d，J＝8.2 Hz，H-6），3.76 （3H，s，3-OCH3）；13C-NMR （C5D5N，150 MHz）δ：124.7 （C-1），113.6 （C-2），148.1（C-3），152.5 （C-4），116.0 （C-5），124.7 （C-6），168.9 （C-7），55.5 （3-OCH3）。以上数据与文献［12］ 报道基本一致，故鉴定为香草酸。

化合物6：白色粉末。1H-NMR （C5D5N，600 MHz）δ：7.90 （2H，s，H-2，6），3.82 （6H，s，3，5-OCH3）；13C-NMR （C5D5N，150 MHz）δ：121.8 （C-1），108.2 （C-2），148.5 （C-3），142.1 （C-4），148.5 （C-5），108.1 （C-6），169.0 （C-7），56.0 （3，5-OCH3）。以上数据与文献［12］ 报道基本一致，故鉴定为丁香酸。

化合物7：白色粉末。1H-NMR （C5D5N，600 MHz）δ：1.38 （3H，s，H-19），1.64 （3H，s，H-18），1.48 （3H，s，H-21），2.71 （1H，s，H-9），3.88 （1H，m，H-3），4.35 （1H，m，H-12α），4.60 （1H，m，H-11β）；13C-NMR（C5D5N，150 MHz）δ：38.7 （C-1），31.5 （C-2），72.1 （C-3），38.3 （C-4），46.6 （C-5），28.2（C-6），33.8 （C-7），78.8 （C-8），59.0 （C-9），36.0 （C-10），71.2 （C-11），72.1 （C-12），45.3（C-13），81.4 （C-14），34.9 （C-15），23.6 （C-16），54.4 （C-17），17.9 （C-18），16.0 （C-19），99.6 （C-20），24.7 （C-21）。以上数据与文献［13］ 报道基本一致，故鉴定为通关藤苷元A。

化合物8：白色粉末。1H-NMR （C5D5N，600 MHz）δ：4.91 （1H，brs，H-29a），4.74 （1H，brs，H-29b），3.53 （1H，m，H-3），1.82 （3H，s，H-30），1.22 （3H，s，H-27），1.04 （3H，s，H-26），1.03 （3H，s，H-25），1.02 （3H，s，H-24），0.79 （3H，s，H-23）；13C-NMR （C5D5N，150 MHz）δ：179.0 （C-28），151.2 （C-20），109.7 （C-29），77.9 （C-3），56.5 （C-17），55.7（C-5），50.7 （C-9），49.5 （C-19），47.5 （C-18），42.6 （C-14），40.9 （C-8），39.3 （C-1，4），38.3 （C-13），37.4 （C-10），37.3 （C-22），34.6 （C-7），34.3 （C-21），32.7 （C-16），31.0（C-15），30.1 （C-23），28.1 （C-2），25.9 （C-12），22.0 （C-11），19.2 （C-30），18.5 （C-6），16.4 （C-24），16.2 （C-25），16.1 （C-26），14.7（C-27）。以上数据与文献［14］ 报道基本一致，故鉴定为白桦脂酸。

化合物9：白色粉末。1H-NMR （C5D5N，600 MHz）δ：1.01 （3H，t，J＝2.8 Hz，H-4'），1.05（3H，d，J＝2.8 Hz，H-3'），1.21 （3H，s，H-19），1.26 （3H，s，H-18），1.53 （3H，d，J＝6.0 Hz，H-6‴），2.03 （3H，s，H-6″），2.24（3H，s，H-21），2.88 （1H，brd，J＝6.5 Hz，H-17β），3.60 （3H，s，3″-OCH3），3.82 （3H，s，3‴-OCH3），4.15 （1H，brs，H-3‴），4.80 （1H，d，J＝9.5 Hz，H-1″），4.81 （1H，d，J＝8.0 Hz，H-1‴），4.82 （1H，d，J＝10.0 Hz，H-12α），5.67 （1H，t，J＝10.0 Hz，H-11β）；13C-NMR（C5D5N，150 MHz）δ：35.6 （C-1），30.5 （C-2），71.4 （C-3），38.1 （C-4），44.5 （C-5），27.3 （C-6），32.5 （C-7），67.1 （C-8），52.1（C-9），39.7 （C-10），69.2 （C-11），80.0 （C-12），46.5 （C-13），72.4 （C-14），27.1 （C-15），25.2 （C-16），62.3 （C-17），9.5 （C-18），13.1（C-19），209.8 （C-20），30.2 （C-21），170.4（12-COOH），20.8 （12-COOH），175.71 （C-1'），34.5 （C-2'），18.3 （C-3'），18.8 （C-4'），97.2（C-1″），38.2 （C-2″），83.8 （C-3″），83.0 （C-4″），73.1 （C-5″），18.4 （C-6″），57.5 （3″-OCH3），101.8 （C-1‴），73.1 （C-2‴），84.5 （C-3‴），74.8 （C-4‴），71.8 （C-5‴），18.9 （C-6‴），61.8 （3‴-OCH3）。以上数据与文献［15］ 报道基本一致，故鉴定为11-O-异丁酰基-12-O-乙酰基通关藤苷元B-3-O-茯苓二糖苷。

化合物10：白色粉末。1H-NMR （C5D5N，600 MHz）δ：1.02 （3H，t，J＝7.5 Hz，H-4'），1.17（3H，d，J＝7.0 Hz，H-5'），1.21 （3H，s，H-19），1.28 （3H，s，H-18），1.54 （3H，d，J＝6.0 Hz，H-6‴），2.01 （3H，s，H-6″），2.24（3H，s，H-21），2.90 （1H，brd，J＝6.5 Hz，H-17β），3.55 （3H，s，3″-OCH3），3.85 （3H，s，3‴-OCH3），4.15 （1H，brs，H-3‴），4.82 （1H，d，J＝9.5Hz，H-1″），4.92 （1H，d，J＝8.0 Hz，H-1‴），4.99 （1H，d，J＝10.0 Hz，H-12α），5.67 （1H，t，J＝10.0 Hz，H-11β）；13C-NMR（C5D5N，150 MHz）δ：35.6 （C-1），30.5 （C-2），71.4 （C-3），38.1 （C-4），44.5 （C-5），27.3 （C-6），32.5 （C-7），67.1 （C-8），52.1（C-9），39.7 （C-10），68.5 （C-11），80.0 （C-12），46.5 （C-13），72.4 （C-14），27.1 （C-15），25.2 （C-16），62.3 （C-17），9.5 （C-18），13.1（C-19），210.5 （C-20），30.2 （C-21），171.0（12-COOH），20.8 （12-COOH），174.0 （C-1'），44.3 （C-2'），26.6 （C-3'），11.6 （C-4'），15.6（C-5'），97.9 （C-1″），38.2 （C-2″），86.5 （C-3″），83.6 （C-4″），73.2 （C-5″），18.6 （C-6″），57.5 （3″-OCH3），102.4 （C-1‴），73.7 （C-2‴），84.5 （C-3‴），75.0 （C-4‴），72.1 （C-5‴），19.2（C-6‴），62.5 （3‴-OCH3）。以上数据与文献［16］ 报道基本一致，故鉴定为通关藤苷H。

化合物11：白色粉末。1H-NMR （C5D5N，600 MHz）δ：1.21 （3H，s，H-19），1.25 （3H，s，H-18），1.52 （3H，d，J＝6.5 Hz，H-6‴），1.56（3H，d，J＝6.0 Hz，H-6″），1.65 （3H，d，J＝5.5 Hz，H-4'），1.77 （3H，s，H-5'），2.12（1H，brd，J＝6.5 Hz，H-17β），2.42 （1H，brd，J＝9.5 Hz，H-4‴），2.91 （3H，s，3″-OCH3），3.50 （3H，s，3‴-OCH3），3.81 （1H，brs，H-3‴），4.14 （1H，d，J＝8.0 Hz，H-1″），4.77（1H，d，J＝8.0 Hz，H-1‴），5.30 （1H，d，J＝8.0 Hz，H-12α），5.42 （1H，d，J＝10.0 Hz，H-11β），6.86 （1H，q，J＝5.5 Hz，H-3'）；13CNMR （C5D5N，150 MHz）δ：37.5 （C-1），29.5（C-2），75.8 （C-3），34.9 （C-4），43.7 （C-5），27.0 （C-6），25.0 （C-7），66.5 （C-8），51.6（C-9），39.1 （C-10），68.8 （C-11），74.9 （C-12），45.9 （C-13），71.5 （C-14），31.9 （C-15），26.9 （C-16），59.4 （C-17），13.9 （C-18），16.7（C-19），210.0 （C-20），30.0 （C-21），170.4（12-COOH），20.2 （12-COOH），167.0 （C-1'），128.8 （C-2'），138.0 （C-3'），11.9 （C-4'），14.1 （C-5'），97.3 （C-1″），37.5 （C-2″），79.4（C-3″），83.0 （C-4″），71.7 （C-5″），18.4 （C-6″），56.9 （3″-OCH3），101.8 （C-1‴），73.0 （C-2‴），83.8 （C-3‴），74.4 （C-4‴），70.7 （C-5‴），18.9 （C-6‴），61.8 （3‴-OCH3）。以上数据与文献［16］ 报道基本一致，故鉴定为通关藤苷G。

化合物12：白色粉末。1H-NMR （C5D5N，600 MHz）δ：1.39 （3H，s，H-19），1.48 （3H，s，H-18），1.54 （3H，d，J＝6.5 Hz，H-6‴），1.70（3H，d，J＝4.5 Hz，H-6″），1.81 （1H，m，H-5″），1.90 （1H，s，H-17β），2.55 （2H，dd，J＝14.0，11.0 Hz，H-2″），2.69 （1H，s，H-9），3.21 （1H，d，J＝8.5 Hz，H-4‴），3.82 （1H，t，J＝2.5 Hz，H-3‴），4.19 （1H，dd，J＝6.5，4.0 Hz，H-12α），4.35 （1H，t，J＝5.5 Hz，H-11β），4.88 （1H，d，J＝9.5 Hz，H-1‴）；13C-NMR（C5D5N，150 MHz）δ：38.1 （C-1），29.8 （C-2），77.4 （C-3），35.5 （C-4），46.9 （C-5），28.9 （C-6），25.6 （C-7），67.1 （C-8），52.1（C-9），39.7 （C-10），70.3 （C-11），75.5 （C-12），46.0 （C-13），71.3 （C-14），34.7 （C-15），27.5 （C-16），60.0 （C-17），13.4 （C-18），16.6（C-19），210.5 （C-20），30.5 （C-21），171.0（12-COOH），20.6 （12-COOH），166.5 （C-1'），131.9 （C-2'），130.2 （C-3'），129.4 （C-4'），134.9 （C-5'），129.4 （C-6'），130.2 （C-7'），97.8 （C-1″），36.5 （C-2″），79.9 （C-3″），83.5（C-4″），72.3 （C-5″），19.0 （C-6″），57.4 （3″-OCH3），102.4 （C-1‴），73.6 （C-2‴），84.4 （C-3‴），74.9 （C-4‴），72.1 （C-5‴），19.4 （C-6‴），62.4 （3‴-OCH3）。以上数据与文献［16］ 报道基本一致，故鉴定为通关藤苷I。

4 细胞毒活性研究

采用MTT 法进行细胞毒活性评价［17］。将处于对数生长期的A549、Bel-7402 细胞用0.25% 胰酶消化成细胞悬液，调整细胞密度为5×104／mL，接种于96 孔板中，每孔100 μL，培养24 h 后，吸弃原培养液，分为对照组、阳性组（5-氟尿嘧啶）、实验组。除对照组外，其余各组加入含相应的培养基，质量浓度为12.5、25、50、75、100 μg／mL，每孔100 μL，设置3 个复孔，对照组加入等体积无血清培养基。给药48 h 后，每孔加入20 μL 5 μg／mL MTT 溶液，混匀后孵育4 h，吸弃上清液，加入150 μL DMSO，振荡混匀15 min，待其各孔中紫色结晶完全溶解后，在490 nm 波长处测定光密度（OD） 值，重复3 次，计算细胞存活率，公式为细胞存活率＝（OD实验组／OD对照组） ×100%。通过SPSS 软件计算IC50值，数据以（±s） 表示。

结果显示，化合物1～2、7、10、12 能抑制A549、Bel-7402 细胞的生长，IC50值均小于25 μmol／L，具有细胞毒活性，其中化合物1～2 活性最强，与阳性药物5-氟尿嘧啶作用相当。其余化合物未显示出明显细胞毒活性，IC50值大于100 μmol／L。结果见表2。

表2 各化合物对A549、Bel-7402 细胞的IC50值（μmol／L，±s，n＝3）Tab．2 IC50 values of various compounds on A549 and Bel-7402 cells（μmol／L，±s，n＝3）

表2 各化合物对A549、Bel-7402 细胞的IC50值（μmol／L，±s，n＝3）Tab．2 IC50 values of various compounds on A549 and Bel-7402 cells（μmol／L，±s，n＝3）

化合物A549Bel-7402 1 8.3±1.37.5±0.4 7.7±0.89.2±0.7 7 14.6±1.820.4±1.2 9＞10024.7±2.6 1014.6±1.322.4±1.8 1119.4±2.1＞100 1220.9±1.117.0±2.0 5-氟尿嘧啶7.2±0.58.4±0.9 2

5 讨论

通关藤除传统应用外，亦开发成抗肿瘤药物——通关藤注射液（消癌平注射液），用于恶性肿瘤，尤其是原发性肝癌、食管癌、胃癌，还具有改善免疫功能、减毒增效作用，常与细胞毒性化疗药物联合应用于肿瘤的治疗［18］，但其抗肿瘤作用物质基础尚不明确［19］。本研究首次对通关藤水提取物中的化学成分进行研究，从中分离得到12 个化合物，其中新化合物1 个，新的天然产物1 个，首次从通关藤中分得的化合物4 个；此外，还分得通关藤苷H、I、G 等。研究发现，通关藤苷元A、通关藤苷H 等具有保护肝癌小鼠肝功能、抑制鼻咽癌细胞增殖及转移等作用［20-21］。本研究结果亦发现，通关藤醇A、12-O-惕各酰基-通关藤苷元A、通关藤苷元A、通关藤苷H、通关藤苷I 等C21甾体类化合物均具有细胞毒活性，本研究结果丰富了通关藤的抗肿瘤作用物质基础，为其进一步开发利用提供了科学参考。