怀菊花总黄酮富集纯化工艺优化及其抗炎活性、成分组成研究

邓晓颜王小兰李 孟张 莉李玉贤*郑晓珂冯卫生

（1.河南中医药大学药学院，河南 郑州 450046；2.河南省中药开发工程技术研究中心，河南 郑州 450046）

怀菊花为菊科植物菊Chrysanthemum morifoliumRamat.的干燥头状花序，具有清热解毒、清肝明目功效，为河南道地药材四大怀药之一［1］。课题组前期对怀菊花及其茎叶化学成分进行研究，发现大量黄酮类化合物［2-3］，并对其抗炎活性进行筛选［4-5］。

中药具有多成分、多靶点、多途径的特点，其有效部位是发挥疗效的物质基础，故如何富集以增强临床疗效是相关研究的关键［6］。黄酮作为怀菊花主要成分，具有抗氧化［7］、降血压［8］作用，并且菊花清热解毒功效与抗炎作用有一定相关性［9］，活性成分主要为黄酮［10］，故对其富集纯化有助于挖掘药材更多药用价值。

目前，关于怀菊花总黄酮的研究主要集中在提取工艺、含量测定方面［11-12］，鲜有涉及纯化方面。因此，本实验采用AB-8 型大孔吸附树脂［13］对怀菊花总黄酮进行富集纯化，响应面法优化工艺，并通过氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL） 诱导的HUVECs增殖细胞模型来评价抗炎活性，HPLC 法来分析成分组成，以期为综合开发该成分提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器 DZTW 型调温电热套（上海力辰邦西仪器科技有限公司）；NVP-1000 型隔膜真空泵、OSB-2000 型旋转蒸发仪、A-1000S 型水流抽气机、FDU-2110 型冷冻干燥机、CA-1116A 型冷却水循环装置（上海爱朗仪器有限公司）；SHH.W21.420型智能恒温水箱（北京市长风仪器仪表公司）；EVOLUTION300 型紫外可见分光光度计（美国赛默飞世尔科技公司）；BSA224S 型电子天平［赛多利斯科学仪器（北京） 有限公司］；Forma 3111 细胞培养箱 （美国Thermo Fisher Scientific 公司）；TS100 倒置显微镜 （日本Nikon 公司）；Milli-Q Advantage A10 超纯水仪（美国Millipore 公司）；全波长酶标仪（美国BioTek 公司）；Centrifuge-5804R小型高速低温冷冻离心机（德国Eppendorf 公司）；SW-CJ-2FD 超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）。

1.2 试剂与药物 芦丁对照品（批号B20771，上海源叶生物科技有限公司）。亚硝酸钠、硝酸铝（天津市风船化学试剂科技有限公司）；氢氧化钠（成都市科隆化学品有限公司）。AB-8 型吸附树脂（沧州宝恩吸附材料科技有限公司）。ox-LDL （批号YB-002-1，广州奕源生物科技有限公司）；IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA 检测试剂盒 （批号KE00021，KE00139，KE00154，武汉三鹰生物科技有限公司）；CCK-8 （批号CA1210）、青霉素-链霉素-庆大霉素混合溶液（批号P1410） （北京索莱宝科技有限公司）；DMEM （批号2338234，美国Gibco 公司）；胎牛血清（批号20010502，杭州四季青生物工程研究所）。其他试剂均为分析纯。

1.3 细胞 人脐静脉内皮细胞（HUVECs），由河南中医药大学第一附属医院李强老师惠赠。

1.4 药材 怀菊花购自河南绿禾药业有限公司，经河南中医药大学药学院董诚明教授鉴定为菊科植物菊Chrysanthemum morifoliumRamat 的干燥头状花序。

2 方法与结果

2.1 总黄酮含量测定

2.1.1 粗提物制备 参考文献［14］ 报道，称取药材20 g，以料液比1 ∶25 加入70%乙醇500 mL，加热回流提取2 次，每次2 h，合并提取液，减压回收乙醇，浓缩液冷冻干燥，即得，提取率为55.2%。

2.1.2 线性关系考察 精密称取芦丁对照品5 mg，70%乙醇溶解并定容至25 mL 量瓶中，分别精密量取0.5、1.5、2.5、3.5、5.5、7.5 mL 至25 mL 量瓶中，依次加入显色剂亚硝酸钠、硝酸铝后定容，以70%乙醇为空白对照，在510 nm 波长处测定吸光度。以芦丁质量浓度为横坐标（X），吸光度为纵坐标 （A） 进行回归，得方程为A＝11.621X+0.003 3 （r＝0.999 0），在0.004 0～0.060 0 mg／mL 范围内线性关系良好。

2.1.3 测定方法 精密量取“2.1.1” 项下浓缩液2.5 mL 至25 mL 量瓶中，70%乙醇超声溶解并定容，得到样品溶液，量取10 mL 至25 mL 量瓶中，按“2.1.2” 项下方法显色，测得总黄酮含量为14.015 mg／mL。

2.2 纯化工艺优化 在单因素试验基础上，采用Box-Behnken 响应面法。

2.2.1 大孔吸附树脂预处理 参考文献［15］ 报道，采用95%乙醇浸泡树脂24 h 以上，充分溶胀后将漂浮杂质除去，湿法装柱，95%乙醇冲柱至冲洗液无白色混浊，大量蒸馏水冲洗至无醇味。

2.2.3 单因素试验 以上样质量浓度、上样液pH值、上样量、乙醇解吸体积分数、水除杂体积、乙醇解吸体积为影响因素，考察它们对纯化工艺的影响。（1） 上样质量浓度，称取6 份预先处理好的AB-8 型树脂10 g，湿法装柱，70%乙醇将浓缩液稀释定容为含总黄酮0.12、0.36、0.56、0.67、0.83、1.46 mg／mL 的上样液各25 mL，分别量取7 mL上样，收集流出液；（2） 上样液pH 值，分别配制pH 值为2、3、4、5、6、8 的0.56 mg／mL 总黄酮溶液，上样，收集流出液；（3） 上样量，配制pH 值为4 的0.56 mg／mL 总黄酮溶液，上样2 BV，分别在0.4、0.8、1.2、1.6、2 BV 收集过柱液；（4） 乙醇解吸体积分数，配制pH 值为4 的0.56 mg／mL 总黄酮溶液，上样0.9 BV，4 BV 蒸馏水除杂，分别用70%、80%、90%、95% 乙醇各2 BV 解吸，收集解吸液；（5） 水除杂体积，配制pH 值为4 的0.56 mg／mL 总黄酮溶液，上样，分别用2、3、4、5、6 BV 蒸馏水除杂，2 BV 80%乙醇解吸，收集解吸液；（6） 乙醇解吸体积，配制pH 值为4 的0.56 mg／mL 总黄酮溶液，上样，4 BV蒸馏水除杂，分别用0.5、1、2、3、4 BV 80%乙醇解吸，收集解吸液，结果见图1。

图1 单因素试验结果Fig．1 Results of single factor tests

由此可知，吸附率、解吸率都随着各影响因素增加先升后降，当上样液质量浓度为0.56 mg／mL，pH 值为4 时，树脂吸附饱和，吸附率达到最大。前期报道，当流出液中总黄酮质量浓度达到上样液体积分数的10%时，即达到泄漏点［16］，而本实验发现，上样1.2 BV 时已超过泄漏点，故选取接近泄漏点的0.9 BV 作为最优上样量。另外，用4 BV水除杂，2 BV 80%乙醇解吸时，总黄酮解吸完全并不被稀释，解吸率达到最大。最终，分别选择80%、2 BV、4 BV 作为乙醇解吸体积分数、乙醇解吸体积、水除杂体积的响应面中心点。

2.2.4 Box-Behnken 响应面法 结合单因素试验结果，选择乙醇解吸体积分数（A）、乙醇解吸体积（B）、水除杂体积（C） 作为影响因素，解吸率（Y） 作为评价指标，设计三因素三水平试验，具体见表1，结果见表2。

表1 因素水平Tab．1 Factors and levels

表2 试验设计与结果Tab．2 Design and results of tests

采用Design-Expert 11.0 软件对表2 数据进行二次多项式拟合，得方程为Y＝84.93+2.88A+10.26B+ 2.31C-0.256 3AB-3.28AC+ 4.34BC-12.86A2-20.56B2-5.74C2，结果见表3。由此可知，模型P＜0.01，具有高度显著性；失拟项P＞0.05，表明是由随机误差引起的残差［17］；确定系数R2＝0.933 2，AdjustedR2＝0.847 3，表明模型拟合程度较好，响应值变化有84.73%来源于影响因素；因素B、A2、B2有极显著影响（P＜0.01）；各因素影响程度依次为B＞A＞C。

表3 方差分析Tab．3 Analysis of variance

响应面分析见图2［18-19］。由此可知，因素B对解吸率的影响最大，A次之，C最小，与表2 结果一致；各因素交互项影响程度依次为BC＞AC＞AB。

图2 各因素响应面图Fig．2 Response surface plots for various factors

2.2.5 验证试验 按“2.2.4” 项下结果，得到最优纯化工艺为乙醇解吸体积分数80.73%，乙醇解吸体积2.28 BV，水除杂体积4.28 BV，考虑到实际可操作性，将其调整为乙醇解吸体积分数80%，乙醇解吸体积2 BV，水除杂体积4 BV。按优化工艺进行3 批验证试验，测得平均解吸率为84.93%，与预测值86.80%接近；纯化前总黄酮纯度为11.74%，而纯化后升至52.71%，表明该工艺稳定可靠。

2.3 抗炎活性研究

2.3.1 细胞培养、分组及给药 HUVECs 细胞复苏后，用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培养基进行培养，设定温度为37 ℃ （含5% CO2），分为对照组（正常培养基培养48 h）、ox-LDL 组（正常培养基培养24 h 后，150 μg／mL ox-LDL 处理24 h）、给药组（500 μg／mL 总提物及25、50、100 μg／mL总黄酮含药培养基培养24 h 后，150 μg／mL ox-LDL 处理24 h），每组6 个复孔。

2.3.2 总黄酮对细胞增殖的影响 将HUVECs 细胞悬液接种于96 孔板（密度4.0×104／孔），细胞贴壁后更换无血清的培养基培养24 h 使其生长同步化，分组并给药24 h 后取上清液，加入100 μL新鲜培养基，再加入10 μL CCK-8 孵育4 h，在全波长酶标仪540 nm 波长处检测吸光度，计算细胞增殖率［20］，公式为增殖率＝（实验组吸光度／对照组吸光度） ×100%，结果见图3。由此可知，与对照组比较，ox-LDL 组细胞增殖率降低（P＜0.01）；与ox-LDL 组比较，总提物、总黄酮组细胞增殖率升高（P＜0.05，P＜0.01），并且总黄酮组呈一定剂量依赖性。

图3 怀菊花总黄酮对ox-LDL 诱导HUVECs 细胞增殖率的影响Fig．3 Effect of total flavonoids from Huai Chrysanthemum on proliferation rate of HUVECs cells induced by ox-LDL

2.3.3 总黄酮对炎症因子水平的影响 将“2.3.2”项下细胞上清液在4 ℃下离心5 min 后，按照ELISA 试剂盒说明书检测IL-1β （图4A）、IL-6（图4B）、TNF-α （图4C） 水平，结果见图4。由此可知，与对照组比较，ox-LDL 组IL-1β、IL-6、TNF-α 水平升高（P＜0.05，P＜0.01）；与ox-LDL组比较，总提物、100 μg／mL 总黄酮组IL-1β、IL-6 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），总提物、不同剂量总黄酮组TNF-α 水平降低（P＜0.05，P＜0.01）。

图4 怀菊花总黄酮对ox-LDL 诱导HUVECs 细胞炎症因子水平的影响Fig．4 Effects of total flavonoids from Huai Chrysanthemum on inflammatory factor levels in HUVECs cells induced by ox-LDL

2.4 成分组成分析 采用HPLC 法。

2.4.1 色谱条件 Symmetry C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈 （A）-0.2% 磷酸（B），梯度洗脱 （0～5 min，11%～16% A；5～15 min，16%A；15～18 min，16%～19%A；18～30 min，19%A；30～35 min，19%～22% A；35～55 min，22%A；55～57 min，22%～28% A；57～70 min，28%A；70～95 min，28%～80%A）；体积流量1.0 mL／min；柱温30 ℃；检测波长270 nm；进样量10 μL。

2.4.2 对照品溶液制备 取各对照品适量，置于10 mL 量瓶中，甲醇超声溶解，定容，制成分别含101 μg／mL 木犀草苷、201 μg／mL 异绿原酸A、107 μg／mL 芹菜素-7-O-葡萄糖苷、759.05 μg／mL香叶木素-7-O-葡萄糖苷、796 μg／mL 木犀草素、663.48 μg／mL 金合欢素-7-O-葡萄糖苷、832 μg／mL芹菜素、762 μg／mL 香叶木素、855 μg／mL 金合欢素的贮备液，分别取0.5 mL，甲醇稀释1 倍，过0.22 μm 微孔滤膜，即得。

2.4.3 供试品溶液制备 取纯化后的总黄酮冻干粉约1 mg，置于锥形瓶中，加1 mL 甲醇溶解，摇匀，过0.22 μm 微孔滤膜，即得。

2.4.4 结果分析 取对照品、供试品溶液适量，在“2.4.1” 项色谱条件下进样测定，通过比对色谱峰保留时间、紫外最大吸收波长结合相关文献确认成分，结果见图5，共发现9 种成分，包括8 种黄酮、1 种有机酸，分别为木犀草苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、香叶木素-7-O-葡萄糖苷、木犀草素、金合欢素-7-O-葡萄糖苷、芹菜素、香叶木素、金合欢素、异绿原酸A。

图5 各成分HPLC 色谱图Fig．5 HPLC chromatograms of various constituents

3 讨论与结论

在纯化工艺中，上样液浓度大、黏性增加、杂质增多、pH 过高或过低均会造成黄酮存在形式发生变化，从而影响大孔吸附树脂吸附，并且在除杂、解吸时其用量过大也会将吸附上的黄酮解吸下来而造成损失。纯化前，怀菊花总提物冻干粉呈偏黑褐色，易吸潮而变黏稠；纯化后，它呈偏黄棕色，吸湿性降低，总黄酮纯度明显提高。

在前期研究基础上，本实验采用ox-LDL 诱导HUVECs 细胞损伤模型，评价怀菊花总提物及其总黄酮对HUVECs 细胞的保护作用。结果显示，总黄酮可通过降低细胞炎性因子分泌来保护内皮细胞，具有潜在的抗动脉粥样硬化活性，但其药效和作用机制还有待通过体内药理实验作进一步研究。

目前，关于怀菊花所含成分含量测定的报道大多只涉及2020 年版《中国药典》 规定的3 种指标成分［21］（绿原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸），仅王月茹［22］测定了其他5 种黄酮含量。本实验采用HPLC 法指认了怀菊花总黄酮中8 种黄酮、1 种有机酸，数量多于目前相关文献所发表，可为该药材开发利用提供参考依据，具有一定实际意义。