线粒体病的分子诊断与疾病标志物

董起钰,尹筱婕,钟 声,范双龙,方合志,王 娅

(浙江省医学遗传学重点实验室,温州医科大学检验医学院生命科学学院,浙江 温州 325035)

线粒体疾病(也称线粒体病)是儿童时期最为常见的一类先天性遗传代谢病,目前尚无根本的治疗方法。因此,早发现、早诊断对于线粒体病的防治至关重要。由于线粒体病临床表型的多样性和复杂性,导致线粒体病诊断尤为困难,极易漏诊误诊,往往需要结合临床、病理、生化以及分子检测综合进行诊断。其中临床诊断是线粒体病诊断的基础,但当临床不能确诊时,分子诊断对线粒体病的确诊起到了“一锤定音”的作用。本文主要介绍了线粒体病的分子诊断策略和疾病诊断标志物。

1 线粒体病

线粒体病最早发现于1962年,并被定义为一类存在氧化磷酸化(OXPHOS)功能异常的遗传代谢性疾病。随着酶生化技术、细胞学、尤其是基因组学技术的发展,线粒体病被进一步定义为:一类线粒体功能异常所导致的疾病,其中OXPHOS功能缺陷是其主要特征[1]。线粒体病临床表现多样,可累及人体多个脏器[2],疾病亚型多达300余百种,其中常见的线粒体病有线粒体脑肌病伴乳酸酸中毒和卒中样发作综合征(MELAS)、亚急性坏死性脑病(Leigh综合征)、Kearns-Sayre综合征(KSS)、慢性进行性眼外肌瘫痪(CPEO)、肌阵挛性癫痫伴肌肉蓬毛样红纤维综合征(MERRF)等。虽然单一的线粒体疾病亚型发病率低,但总发病率可高达1/5000[3],是儿童时期最为常见的先天性遗传代谢病。已知有1200余种蛋白定位于线粒体中,其中绝大多数蛋白质由核基因(nDNA)编码,而线粒体基因(mtDNA)仅编码了其中的13种亚基,2种rRNA和22种tRNA[4]。因此,线粒体病的遗传方式可分为nDNA突变介导的孟德尔遗传方式和mtDNA突变介导的母系遗传方式。

2 线粒体病的遗传特点

线粒体是一个半自主性细胞器,能够进行自我复制、转录和翻译。与nDNA相比,mtDNA具有如下特点:①母系遗传,这是因为精子在发育成熟后只有很少的线粒体,且在受精后自行降解,子代中mtDNA几乎全部来自于卵细胞,而表现为母系遗传。但近年研究也显示在少数情况下,父亲可以将mtDNA遗传给后代;②复制分离,在细胞分裂过程中,mtDNA随机分配到子细胞中,导致子细胞含不同比例的突变mtDNA分子。分裂旺盛的细胞往往会排斥突变型mtDNA,使细胞中野生型mtDNA比例逐渐增加。而在分裂不活跃的细胞中则出现相反的情况[5];③高突变率,主要因为mtDNA无组蛋白保护,缺乏损伤修复系统,且与线粒体内膜相连,极易被呼吸链代谢产生的氧自由基损伤;④阈值效应,突变型mtDNA达到一定水平导致线粒体产能急剧下降,组织或器官缺乏能量供应从而表现出临床症状。能量需求越高的组织器官的阈值越低,对线粒体功能异常越敏感[6]。

3 线粒体病的分子诊断与疾病标志物

3.1 线粒体病分子诊断由于线粒体病临床表现的多样性和复杂性,给线粒体病的诊断带来巨大挑战。线粒体病的诊断需结合临床诊断、肌肉病理学检查、生化检测以及分子诊断综合进行分析[7]。临床诊断是线粒体病诊断的基础,但当临床不能确诊时,分子诊断起到了决定性作用。1988年,Wallace等首次发现m.11778G>A是Leber’s遗传性视神经病(LHON)的致病突变[8]。随后Goto等在1990年发现了第二个线粒体病致病突变(m.3243A>G)[9]。过去十几年随着高通量测序在线粒体病分子诊断中的应用,至今已发现400余个线粒体致病基因。由于线粒体病基因型-表型间存在一定关联,因此可结合临床表现,针对性进行基因检查。见表1。

表1 线粒体病相关基因突变及临床表现

Leigh综合征又称为亚急性坏死性脑病,是由遗传缺陷导致线粒体功能障碍引起的神经退行性病变,发病率约为1/40000[10]。Leigh综合征起病早,病程进展迅速,预后较差。病因复杂,主要由线粒体呼吸链复合体缺陷(ACAD9、NDUFS1、SDHA等核基因或MTND1、MTCO3等线粒体基因突变导致);丙酮酸羧化酶或丙酮酸脱氢酶复合物缺陷(DLD、PDHA1、TPK1等基因突变导致);辅酶Q等辅助因子合成障碍(COQ9、PDSS2突变导致),患者脑干、双侧基底节区、小脑、脊髓等部位对称性局灶性坏死,并表现生长发育迟缓、肌力下降或肌张力异常等临床症状。

MELAS综合征是一种常见的线粒体脑肌病,患者临床多表现为癫痫、卒中样发作、头痛等,基因检测是确诊MELAS综合征的重要标准[11]。自Goto等于1990年首次报道m.3243A>G突变导致MELAS的病例,更多的mtDNA变异位点被发现,如m.3271T>C、m.3252A>G、m.3291T>C、m.3260A>G等,其中大部分突变位于mtDNA的tRNA基因区域。

MERRF综合征又称肌阵挛癫痫伴破碎红纤维综合征,是线粒体脑肌病的一个亚型,患者多在儿童期发病。由于突变基因或位点不同,患者的临床表型各异,以肌阵挛性癫痫发作为主要特征, 可伴有智力减退、小脑共济失调等,此外,还会出现如甲状腺功能减退等其他内分泌系统疾病。线粒体DNA突变导致线粒体氧化磷酸化功能缺陷是发病的根本原因,m.8344A>G、m.8356T>C、m.8361G>A和m.8363G>A是常见的致病性突变,其中m.8344A>G是MERRF相关的热点突变。

LHON又称Leber遗传性视神经萎缩,该病于1871年首次报道,以双眼出现无痛性视力下降为首发症状,随着病情进展,可出现显著的双侧视神经萎缩,伴随或不伴随其他多系统症状,如运动障碍、癫痫、听力障碍等。约95%的LHON患者由m.11778G>A、m.14484T>C和m.3460G>A这三个点的突变引起。

Kearns-Sayre综合征于1958年由Kearns和Sayre首次报道,是一种以慢性进行性眼外肌麻痹、视网膜色素变性和心脏传导功能障碍三联征为主要特征的线粒体脑肌病。KSS最常见病因是由DNA的重排导致的线粒体DNA单个或多个片段缺失,常见的致病性突变位点包括m.4298G>A、m.4308G>A、m. 5703G>A和m.12315G>A等。

3.2 线粒体病分子诊断技术mtDNA突变形式有多种,包括点突变、重复和缺失等,其中主要以点突变为主。mtDNA突变的检测方法主要包括PCR-RFLP和PCR-ASO等。对于A3243G、T8993G等常见的线粒体DNA点突变,通常使用PCR-RFLP法。该方法是通过PCR扩增一段含有突变位点的mtDNA,然后再使用合适的限制性内切酶,酶切PCR产物,经琼脂糖凝胶电泳得到特异性的电泳谱带,野生型mtDNA所得的PCR产物会被切成2个片段,从而鉴定该位点是否发生突变。该方法较简便,特异性高,适合同时检测多个样本,并且通过扫描野生型及突变型DNA条带信号强度可以粗略计算突变型mtDNA的比例。但此方法耗时,结果不稳定,限制性内切酶可能消化不完全。此外,PCR-RFLP法可能无法检测到低百分比(<15%)的异质性。为了更有效地诊断线粒体病,可使用多重PCR /等位基因特异性寡核苷酸(ASO)点印迹杂交方法。患者DNA样本含有野生型或突变型mtDNA,将其PCR产物与相应的核酸探针杂交,野生型的mtDNA只结合正常探针,同质突变型的mtDNA只结合突变探针,而异质突变型的mtDNA将与野生型和突变型ASO探针杂交。该方法灵敏度高,能同时分析多个位点突变。对于低百分比的突变异质性也可以检测。但不能进行定量检测。

对于大片段缺失可采用Southern杂交进行检测,基本原理是经限制性内切酶酶切后的DNA片段,琼脂糖凝胶电泳及变性后,转移至固相支持物上,与相应的标记探针进行杂交。使用Southern杂交时需注意检测样本的选择。由于mtDNA缺失的线粒体病患者,其不同组织中含有的突变型mtDNA比例不同,在肌肉和脑等组织中突变型mtDNA比例较高,但在血液中可能检测不到。

对于一些尚不清楚的点突变可采用单链构象多态性(SSCP)、变性高效液相层析(dHPLC)、变性梯度凝胶电泳(DDGE)及DNA测序等进行检测。SSCP是基于单链DNA构象的差别来检测突变。相同长度的单链DNA由于碱基序列不同,形成不同的空间构象,在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中表现为不同的迁移率,区分野生型DNA和突变型DNA。SSCP操作简单,能够快速、有效地检测各种类型的突变,如点突变、缺失和重复等,但如果突变导致空间构象变化微小,迁移率相差无几,会出现假阴性,进而影响检测的灵敏度。dHPLC方法可以筛查未知单核苷酸多态性和突变,具有高通量、自动化、特异性高、快速等优点,是分析异质性突变首选的检测方法。该方法主要通过PCR扩增得到相同长度的DNA片段,突变型DNA片段和野生型DNA片段只有一个位点的差异,退火后可形成同源双链和异源双链,两者在层析柱中的移动速度不同,异源双链因有错配区的存在而更易变性,在色谱柱中的保留时间短于同源双链,故先被洗脱下来,野生型和突变型得以区分,由此达到检测基因突变的目的。目前也有许多研究将DDGE变性高效液相层析技术用于检测mtDNA突变[12]。因不受其他筛选方法敏感性和特异性的限制,DNA测序技术是进行突变分析最直接和最准确的方法,已成为检测基因突变的金标准。DNA测序技术主要包括第一代测序技术(Sanger测序)、第二代测序技术(NGS)和第三代测序技术。近年来,NGS被广泛用于研究mtDNA缺陷,主要适用于检测mtDNA大片段缺失和异质率,已成为mtDNA遗传分析的首选方法[14～18]。NGS主要包括全基因组测序(WGS)和全外显子测序(WES),其中WGS是对生物体整个基因组序列进行测序,可以获得完整的基因组信息,能够鉴定出基因组上任何类型的突变,覆盖内含子和外显子区域,能同时分析线粒体基因组项目以及动态突变项目。不同于WGS,WES关注基因组的外显子区域,即蛋白质编码区域,是目前更适用于临床的高深度测序技术。虽然外显子组只占基因组的1%～2%,却包含约85%的致病突变。与全基因组测序相比,全外显子测序检测目标区域明确,更加经济高效,对研究SNP、InDel等具有较大的优势,可以凭借高深度测序鉴定到全基因组测序所没有鉴定到的突变,但不能检测大片段缺失。DNA测序技术促进了突变鉴定速度的提高以及新致病基因的发现,助力了线粒体病快速诊断[13]。总之,这些技术推动了线粒体病分子诊断的迅速发展,为临床快速确诊提供了更精准的信息。

3.3 线粒体疾病标志物与线粒体功能障碍相关的多种生化物质统称为线粒体疾病标志物,包括脑脊液乳酸、丙酮酸、血氨基酸、尿有机酸等,上述标志物水平的检测对线粒体病诊断具有重要意义。

乳酸/丙酮酸比值。线粒体病患者安静时脑脊液、血清和尿液中的乳酸水平通常升高,导致乳酸与丙酮酸比值随之变化,一般认为安静时乳酸与丙酮酸比值大于20,提示患者线粒体呼吸链复合体功能缺陷和丙酮酸代谢受损[19]。但值得注意的是,运动和抽血应激会导致患者血乳酸水平急剧上升,因此测定乳酸水平时需排除该干扰因素。

血浆氨基酸及尿有机酸。血浆氨基酸及尿有机酸检测一定程度上也可帮助鉴别线粒体病。目前在临床上多采用串联质谱法进行血浆氨基酸和尿有机酸检测。患者血浆中丙氨酸水平异常升高,提示线粒体功能障碍。临床上一般将丙氨酸与酪氨酸等必需氨基酸进行比较,以明确丙氨酸水平的相对值是否升高。MELAS综合征患者的血浆瓜氨酸水平降低[20];部分丙酮酸脱氢酶缺陷患者的缬氨酸等支链氨基酸水平升高。有机酸作为机体代谢的副产物,在线粒体病患者尿液中的水平会出现异常改变,如Barth综合征患者尿液中3-甲基葡聚糖酸水平明显升高;SUCLA2缺乏征患者甲基丙二酸水平明显升高;MEGD(H)EL综合征患者3-甲基戊烯二酸水平升高。

此外,有报道线粒体患者体内成纤维细胞生长因子21(FGF21)[21]和生长分化因子15(GDF15)[22]水平升高,但也有文章指出FGF21和GDF15在肝脏受损的非线粒体病患者体内也会异常升高[23],二者在继发性线粒体病诊断过程中的灵敏度较以往报道低[24],因此并不能将二者作为线粒体病的特异性指标,仅可作为辅助诊断依据。

4 小结

目前线粒体病的诊断需结合临床诊断、病理检查、生化检测以及分子诊断综合进行分析。在临床疑诊时,分子诊断对线粒体病的确诊起到了关键性作用。此外,检测线粒体疾病标志物水平也有助于线粒体病的及时诊断。随着分子生物学和高通量测序技术的发展和应用,相信未来会发现更多线粒体病致病新基因和新突变,也会有更加方便和精准的技术用于线粒体病的生化检测,并通过大量的临床研究发现更多可靠的线粒体疾病标志物,从而提高线粒体病的诊断效率。