血清外泌体miRNA在类风湿关节炎诊疗中的潜在应用价值

杨 平,龚建民,梁 军,严 虹

(1. 南京大学医学院附属鼓楼医院 a.检验科,b.风湿免疫科,江苏 南京 210008;2. 长江大学生命科学学院,湖北 荆州 434025;3. 南京医科大学第二附属医院检验医学中心,江苏 南京 210011)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以全身性炎症和关节疼痛、肿胀、畸形为主要特征的自身免疫性疾病,并且可累及到肺部、心脏和眼睛等关节外器官[1]。目前临床用于RA诊断的实验室指标主要是抗瓜氨酸蛋白抗体(anti-citrullinated protein antibody,ACPA)和类风湿因子[2](rheumatoid factor,RF)。RF在70%～80%的RA患者中均可检测到,但其特异性较低[3];ACPA则更具有特异性,通常与RF同时升高[4]。然而,据报道仍有15%～25%的RA患者的两类抗体均阴性[5],这无疑对临床医生的诊疗提出了挑战,尤其是在早期鉴别阶段。更重要的是,ACPA阴性RA与ACPA阳性RA从病因、病理到疾病免疫微环境都有所不同[6～8]。因此,探寻RA新型标志物鉴定不仅对RA的早期识别至关重要,而且有助于揭示RA潜在的致病机制。新近表观遗传学研究表明微小RNA(microRNA,miRNA)与RA的发生、发展密切相关[9～11]。外泌体是细胞来源的直径约为30～100 nm的具有膜结构的微囊泡,可以介导体内细胞间的远程通讯,其中间充质干细胞来源的外泌体被报道可以用于RA的治疗[12]。外泌体也是循环miRNA的重要载体,可有效保护miRNA免受降解。然而,关于外泌体miRNA是否能够作为RA诊断的标志物以及如何参与RA的发病尚不明确。因此,本研究拟通过对RA患者血清外泌体进行小RNA测序筛选结合大样本qPCR进行验证,初步探讨外泌体miRNA在RA诊疗中的潜在临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2021年2月至2022年6月在南京大学医学院附属鼓楼医院风湿免疫科就诊的RA患者132例,其中男31例,女101例。RA患者全部符合美国风湿病学会及欧洲抗风湿病联盟(ACR/EULAR)2010年共同修订的RA诊断标准。选择同期来院体检健康志愿者127例为对照组(HC组),其中男25例,女102例,排除糖尿病、恶性肿瘤以及其他自身免疫性疾病。两组间年龄、性别比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。RA患者和对照组各选择24例作为训练集,剩余108例RA患者和103例对照组作为测试集;同时收集10例正常体检患者,14例RA患者,10例强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis, AS)患者,12例系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)患者,11例银屑病关节炎(psoriatic arthritis, PsA)患者用于小RNA标志物的特异性分析。同时,收集了9例严格入组的经甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)稳定剂量治疗的成年活动性类风湿关节炎患者,分别检测其治疗前基线水平和治疗后第29天的血清外泌体miRNA水平。收集RA患者肿胀关节数(tender joint count,TJC28)、疼痛关节数(swollen joint count,SJC28)、疾病活动评分(disease activity score,DAS28)-CRP、DAS28-ESR、患者总体评价,根据美国风湿病学会(ACR)改善标准对RA患者治疗的临床效果进行评估。本研究经南京大学医学院附属鼓楼医院伦理委员会审核批准(项目编号:2021-280-01)。

表1 RA组和HC组一般临床资料比较

1.2 样本采集与检测方法所有受试者均空腹静脉采血,ESR检测用枸橼酸钠抗凝管,其余项目用带分离胶血清管,以3000×g相对离心力的速度离心10 min,分离血清,所收标本放于-80 ℃冰箱中保存待用。

1.3 外泌体RNA提取以及小RNA测序分析

1.3.1外泌体分离 使用Exo-Quick-TCTM、Total Exosome Isolation(Invitrogen)试剂盒获得外泌体。根据试剂盒提供说明严格进行以下步骤:将血清16000 g离心30 min取上清,将血清与沉降试剂按照5∶1的比例进行混匀,置于冰上孵育30 min,10000 g离心10 min即可获得外泌体沉淀,接着用纯净的PBS溶液重悬外泌体。

1.3.2外泌体表征及RNA提取 使用透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)观察外泌体形态,使用粒径分析仪(Zetaview)分析外泌体粒径分布,最后通过蛋白印迹(western blot,WB)鉴定外泌体膜特异性蛋白。使用Trizol裂解法提取外泌体总RNA,具体步骤如下:向外泌体中加入1 ml Trizol(Invitrogen),充分混匀,静置5 min;加入200 μl氯仿,充分混匀,于4 ℃静置7 min;16000 g离心20 min,取上清,加入等体积异丙醇,-20 ℃沉淀过夜;4 ℃ 16000 g离心20 min,弃上清;加入1 ml 75%乙醇,4 ℃ 16000 g离心20 min,弃上清,倒置晾干,使用ddH2O重悬,即可得外泌体总RNA。

1.3.3miRNA高通量测序及筛选 使用Qubit荧光计和琼脂糖电泳检测RNA样本的浓度和纯度,将外泌体RNA送至华大基因公司进行测序。测序包括RNA样本添加3’和5’端接头、逆转录、PCR扩增、选择合适大小文库、文库定量和上机测序,所用的测序仪器为Illumina二代测序系统。接着过滤测序数据,删除重复和缺失,与数据库进行比对,使用R语言等生物信息学工具进行分析和注释,选取差异表达的miRNA进行后续的临床样本验证。

1.4 RT-PCR分析miRNA的检测主要包括逆转录和荧光定量PCR两个步骤,选用的是在miRNA研究领域较成熟的茎环引物进行试验。首先使用miRNA design软件设计miRNA逆转和定量引物,使用miRNA 1stcDNA Synthesis Kit(南京诺唯赞生物)试剂盒合成cDNA,再用miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix(南京诺唯赞生物)试剂盒进行定量PCR。以上所有样本的定量检测均在BIO-RAD CFX96 PCR仪(美国伯乐公司)上完成。

1.5 统计学方法采用GraphPad Prism8.0及SPSS 24.0统计学软件进行数据分析。计数资料以频数和百分比表示,组间比较采用卡方检验或Fisher确切概率法;非正态分布的计量资料用M(P25,P75)表示,组间比较采用非参数Mann-WhitneyU检验;使用Pearson相关分析相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 筛选差异表达的外泌体miRNA并进行小样本初筛根据∣log2 FC∣>2,P<0.05的标准对测序原始数据进行分析,筛选出8个在RA组低表达的miRNA,在24对RA患者和健康患者中进行初步验证,发现miR-11400在RA组中显著低表达(P<0.05)。见表2。

表2 RA组低表达外泌体miRNA标志物的筛选

2.2 对外泌体miR-11400进行大样本验证和诊断效能评估对鉴定出的关键miR-11400在大样本队列(103例HC健康志愿者,108例RA患者)中进行验证,ROC曲线下面积为0.7546(图1a)。将miR-11400进一步在ACPA阴性RA患者中进行验证,发现仍然保持极佳的诊断效能,ROC曲线下面积为0.9778(图1b)。

图1 外泌体miR-11400的大样本验证和诊断效能分析 a:大样本队列;b:ACPA阴性RA患者

2.3 外泌体miR-11400与RA临床指标的相关性分析RA组血清外泌体miR-11400水平与CCP、CRP、MCV和RF均呈负相关(P<0.05)。见表3。

表3 外泌体miR-11400与临床指标的相关性分析

2.4 外泌体miR-11400在其他自身免疫性疾病中的特异性分析与HC组比较,外泌体miR-11400只在RA组特异性低表达(P<0.01),而在AS组、SLE组及PsA组差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

图2 外泌体miR-11400在其他自身免疫性疾病中的特异性分析

2.5 外泌体miR-11400在RA患者疗效观察中的价值入组9例连续口服(MTX)稳定剂量(每周剂量7.5～25 mg)治疗的活动性RA患者,观察其治疗前基线水平以及第29天(Day 29)的血清外泌体miRNA表达量的变化。结果表明,经MTX治疗后第29天外泌体miR-11400表达量呈上升趋势,同时TJC28、SJC28和DAS28-CRP评分均显著降低(P<0.05)。见表4。

表4 活动性RA患者MTX治疗前后临床指标比较 (n=9)

2.6 miR-11400可能的机制和信号通路分析采用KEGG分析发现miR-11400主要富集在促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路,而MAPK信号通路与RA的发病机制密切相关。见图3。

图3 miR-11400的生物信息学分析

3 讨论

RA疾病异质性强,发病机制尚不明确,目前认为其发病可能与家族遗传、自身免疫、肠道菌群、表观遗传等有关[12～14]。北京协和医院张烜教授在国际上首次报道其团队通过蛋白芯片技术在累计长达8年收集的上千例标本中筛选出抗PTX3和抗DUSP11两种新型自身抗体可作为ACPA阴性类风湿关节炎的诊断标志物,同时还阐述了抗PTX3和抗DUSP11自身抗体在细胞焦亡和炎性因子风暴中的致病机制[15,16]。北京大学人民医院栗占国教授团队通过一项涉及3262名参与者的训练和验证队列的大规模的多中心研究发现,RA患者的血清可溶性清道夫受体A(soluble scavenger receptor,sSR-A)水平显著升高,并且与该疾病的临床和免疫学特征呈正相关。sSR-A被证实可以用于RA的诊断,尤其是对早期和血清阴性RA的诊断,同时还揭示了靶向sSR-A可能是一种新的RA治疗策略[17]。然而,这些指标均仅限于科研层面,目前RA的血清诊断主要依据RF和CCP,临床上仍有部分患者在发病初期甚至患病多年仍缺乏有效生物标志物进行检测,给临床诊断和治疗带来困难。因此,寻找新型的标志物用于RA的诊断和预后具有十分重要的临床意义。

近年来,循环miRNA标志物与类风湿关节炎的关系得到广泛关注,其动态变化与RA的发病易感性、发病机制、诊断、治疗干预及预后密切相关[11,18]。外泌体不仅可以保护循环miRNA免受降解,同时可以通过运输各种蛋白质和非编码RNA,在细胞间通信中发挥重要作用[19～21]。本研究首次发现了一种在RA患者血清低表达的外泌体miR-11400标志物,在鉴别RA组和HC组的ROC曲线下面积为0.7546(95%CI为0.6874～0.8217),并且在ACPA阴性的RA中也具备极佳的诊断效能(AUC为0.9978,95%CI为0.9468～1.000)。然后,通过spearman相关性分析发现外泌体miR-11400与RA患者的临床指标CCP、RF、CRP和MCV均呈负相关,其中与MCV相关性最好,CCP次之,最后是RF和CRP。进一步特异性分析表明,外泌体miR-11400只在RA组特异性低表达,而在AS组、SLE组以及PsA组与HC组比较差异无统计学意义。以上数据表明,外泌体miR-11400可能与RA的发生、发展密切相关,具有很好的临床价值。

MTX是目前治疗类风湿关节炎最为经典的一线药物,各国指南中均推荐首选单用MTX作为治疗药物[22]。本研究对9例经MTX稳定剂量治疗的成年活动性RA患者进行用药前基线水平以及用药后第29天血清外泌体miR-11400表达量进行分析,发现其在治疗后第29天表达量逐渐增高,同时TJC28、SJC28和DAS28-CRP评分均显著降低,症状趋于好转,这也表明外泌体miR-11400在一定程度上可以用于辅助风湿科医师评估RA的治疗效果。更为重要是,通过生物信息学分析发现miR-11400主要可能靶向MAPK信号通路,而MAPK信号通路是真核生物信号传递网络中的重要途径之一,是正常条件和病理条件下应激反应以及细胞增殖、分化、细胞凋亡的关键信号通路,并且被大量文献报道可能参与RA的发病机制[23～25]。因此,提示miR-11400有可能通过调控MAPK信号通路参与RA的发病,并有可能成为RA治疗中的新的靶点。

综上,本研究发现了miR-11400是一种低表达于RA患者的血清外泌体miRNA,其不仅可以用于RA的诊断,同时可以用于RA治疗过程中的动态监测,具有很好的潜在临床应用价值。同时,通过生物信息学分析揭示了外泌体miR-11400可能通过靶向MAPK信号通路参与RA的发病进程,有望成为RA治疗的新的靶点。然而,本次研究未能够对全部RA患者进行DAS-28评分以及相关影像学的跟踪,因此在后续的研究中将详细完善评分和关节超声、影像学检查用于更精准地评估患者的活动性。本研究的局限性还在于虽然样本量较大,但仍属于单中心、单药物临床数据研究,可能存在选择性、地域性偏倚。因此,在后续的研究中仍需进行跨区域、多中心合作,同时在不同RA治疗方案中的场景下去建立疗效评估模型,以期能够将外泌体miR-11400应用于RA患者的临床诊断和预后评估中去,更好发挥其潜在的临床应用价值。最后,国内外当前有关外泌体检测标准化工作尚处于实验室研究阶段,其分离富集方法、技术操作规范、质量控制以及检测结果的一致性和准确性尚待解决[26,27]。外泌体检测真正进入临床应用,仍需提高检测技术的灵敏度和特异性;实现样本采集系统和分析步骤等的标准化;通过多中心临床试验来综合评价检测的临床效果。相信随着新兴技术的不断涌现和发展,以及广大检验同仁和科研工作者的不懈努力,外泌体相关标志物研究必将在检验领域发挥一定的临床应用价值。