DNA甲基化作为结直肠癌早期诊断标志物的研究进展

林晓宇,王传新,杜鲁涛

(1.山东大学第二医院检验医学中心,山东 济南 250033;2.山东大学齐鲁医院检验医学中心,山东 济南 250012)

结直肠癌(CRC)发病率在恶性肿瘤中位居第三位,死亡率位居第二位[1]。预计到2030年,结直肠癌的全球负担增加60%,将有约220万例结直肠癌新发病例和110万例结直肠癌死亡病例[2]。结直肠癌患者的生存率与其确诊时分期密切相关,I期结直肠癌患者的5年生存率约为91%,而IV期结直肠癌患者的5年生存率仅为14%左右[3, 4]。结直肠癌的早期筛查和诊断可以显著降低其发病率和死亡率[5]。目前结肠镜检查是结直肠癌诊断的金标准,但由于操作具有侵袭性,检查成本较高,且需要提前肠道准备等,其用于结直肠癌早期筛查的人群依从率较低[6]。因此,迫切需要开发新的准确度高、重复性好、简便易行的结直肠癌早期筛查手段。表观遗传修饰在包括结直肠癌在内的多种恶性肿瘤的发生发展中起着关键作用[7]。DNA甲基化是目前研究最多,也是基因组最丰富和最广泛的一种表观遗传修饰,其主要发生在恶性肿瘤的早期阶段,这种遗传修饰改变可以作为肿瘤的早期分子事件提示肿瘤的发生。结直肠癌细胞主要表现出两种不同的DNA甲基化模式的改变,一种是全基因组的低甲基化,另一种是特定基因启动子的高甲基化[8, 9]。近年来,随着对结直肠癌发生发展阶段中DNA甲基化模式等表观遗传修饰的深入了解以及新型分子诊断技术的不断进步,血液、粪便、尿液和肠道灌洗液等人体生物样本中的DNA甲基化等作为结直肠癌早期筛查和诊断的生物标志物的潜能逐渐受到临床关注。这种新型表观遗传修饰标志物具有样本采集简便、无创和风险较小等诸多优点,有望成为下一代结直肠癌早期筛查和诊断的新型检测靶点。本文将系统总结不同来源样本中DNA甲基化生物标志物在结直肠癌应用中的最新进展,为后续结直肠癌早期筛查和诊断新技术的研发和临床应用提供参考。

1 血液样本DNA甲基化在结直肠癌早期诊断中的作用

研究表明,血液中异常的DNA甲基化可能是结直肠癌早期筛查和诊断的潜在生物标志物(表1)。SEPT9是研究最广泛的结直肠癌单一甲基化标志物,Epi proColon是目前唯一获得FDA批准用于结直肠癌筛查的血液检测,已在临床上使用近10年[10]。有结果显示,与健康对照者相比,结直肠癌患者组织和血液样本中SEPT9甲基化水平显著升高。Wu等研究显示,血浆样本中SEPT9甲基化检测对结直肠癌诊断的敏感性为76.6%,特异性为95.9%[11],然而SEPT9甲基化对早期结直肠癌和晚期腺瘤检测的敏感性相对较低[12]。Fu等研究表明,结直肠癌患者血浆SEPT9甲基化的阳性率与肿瘤大小、组织学分级和一般组织学类型相关(P<0.05)。术前和术后血浆SEPT9甲基化状态的改变反映了手术对结直肠癌患者的治疗效果,提示SEPT9甲基化在评价结直肠癌治疗效果和监测复发方面具有重要的应用潜力[13]。Takane等研究发现,在血浆样本中,81%的结直肠癌患者PPP1R3C被甲基化,只有19%的非癌症患者PPP1R3C被甲基化,PPP1R3C和EFHD1联合检测可以提高对结直肠癌诊断的敏感性和特异性[14]。KCNJ12和ZNF132是两种新型的用于结直肠癌诊断的甲基化标志物,检测结直肠癌的敏感性分别为62.4%和56.3%,特异性为88.7%和97.2%,与其他标志物联合检测可以进一步提高诊断的敏感性和特异性[10]。Luo等研究发现,在高危人群中,血浆样本中cg10673833甲基化检测对结直肠癌诊断的敏感性为89.7%,特异性为86.8%,进一步结果显示,其对晚期癌前病变的敏感性为33.3%,略高于SEPT9在检测癌前病变方面的敏感性[15]。

表1 血液样本DNA甲基化对CRC的早期诊断

然而,单一甲基化位点的诊断能力比较有限,研究人员尝试建立基于多个不同甲基化位点的诊断模型,用于结直肠癌的早期检测。有研究选择了三个特异性DNA甲基化标记物——C9orf50、KCNQ5和CLIP4作为新的诊断模型,以上标志物都可以独立区分结直肠癌患者和健康个体的血浆,当三者联合检测时能够达到85%的敏感性和99%的特异性[16]。Bartak等利用SFRP1、SFRP2、SDC2和PRIMA1构建联合诊断模型,结果显示该模型诊断结直肠癌的敏感性为91.5%,特异性为97.3%,诊断腺瘤的敏感性为89.2%,特异性为86.5%[17]。以上研究表明,DNA甲基化模式的改变在结直肠腺瘤阶段就可以观察到,且具有比较高的敏感性和特异性,提示DNA甲基化可用于癌前病变的早期诊断。

2 粪便样本DNA甲基化在结直肠癌早期诊断中的作用

在结直肠癌发生过程中,结肠或直肠腔内出现脱落肿瘤细胞的时间要早于肿瘤细胞开始侵犯血管,因此在结直肠癌早期筛查中粪便样本比血液样本更有优势[18]。随粪便排出的肿瘤细胞中含有的异常DNA遗传学改变可以作为结直肠癌早期诊断的潜在生物标志物(表2)。Han等为了评价粪便样本中SDC2甲基化检测对结直肠癌诊断的性能,招募了634名受试者,结果显示SDC2甲基化检测结直肠癌,与肿瘤分期、位置、性别、年龄等无关的总体敏感性为90.2%,特异性为90.2%,检测早期阶段(0～Ⅱ期)结直肠癌的敏感性为89.1%[19]。另一项研究结果显示,SDC2甲基化是目前发现的较好的单一基因甲基化标志物,其粪便甲基化检测的敏感性为83.1%,特异性为91.2%[20]。TFPI2甲基化是人类结直肠癌中的常见事件,Zhang等研究发现粪便样本中TFPI2甲基化对于结直肠癌检测的敏感性为68.3%,特异性为100%[21, 22],联合SDC2甲基化检测能够提高对结直肠癌和腺瘤诊断的敏感性[23]。Liu等研究发现了粪便样本中4个最佳标志物——COL4A1、COL4A2、TLX2和ITGA4,以上标志物检测结直肠癌的敏感性为82.5%～92.5%,检测腺瘤(≥1cm)的敏感性为41.6%～58.4%,特异性为88.0%～96.4%,是结直肠癌早期诊断中潜在价值较高的标志物[24]。

表2 粪便样本DNA甲基化对CRC的早期诊断

与粪便样本中单基因甲基化标志物相比,多基因联合检测具有更大的优势。Cologuard作为FDA批准的第一个用于多种生物标志物检测的方法,包括对KRAS突变、异常NDRG4和BMP3甲基化、β-actin定量分子分析以及血红蛋白免疫分析的检测,具有较高的敏感性和特异性,它检测结直肠癌和晚期癌前病变的敏感性分别为92.3%和42.4%,特异性为89.8%[25]。2018年,Cologuard被纳入ACS更新的结直肠癌筛查指南[26]。Zhao等研究发现,相比于单独检测SEPT9或SDC2甲基化,粪便ColoDefense检测对诊断结直肠癌显示出更高的敏感性和特异性,分别为90.4%和91.9%,未来有可能成为一种低成本、方便、高效的结直肠癌早期检测工具[27]。有研究显示,在粪便样本中使用COL4A2和TLX2甲基化组合能够检测到91.3%的结直肠癌和51.9%的晚期腺瘤,特异性为97.6%,这为粪便DNA检测提供了更准确的甲基化标志物[24]。

3 尿液样本DNA甲基化在结直肠癌早期诊断中的作用

循环肿瘤细胞DNA通过肾小球过滤经尿液排出,使尿液分析成为一种真正无创的癌症检测方法。目前关于尿液样本中DNA甲基化检测用于结直肠癌早期诊断的研究相对较少,但尿液作为一种生物液体,有其独特的优势。Xiao等在76例结直肠癌病例中开展研究,发现有55例尿液样本NDRG4甲基化检测为阳性,特异性为85%,提示NDRG4甲基化可以作为尿液样本中用于结直肠癌诊断的候选生物标志物[28]。2021年,Bach等通过分析尿液中肿瘤来源的DNA甲基化片段来评估其检测结直肠癌的可行性,对92例结直肠癌患者和63例健康对照者的尿液样本进行DNA甲基化分析,结果显示SEPT9作为结直肠癌检测的潜在尿液生物标志物显示出较好的准确性。与健康对照者相比,结直肠癌患者尿液上清液中SEPT9甲基化水平显著升高(P<0.0001),SEPT9和SDC2组成的联合诊断模型能够检测到尿液上清液中高达70%的结直肠癌病例,特异性为86%[29]。以上研究表明,尿液样本DNA甲基化为结直肠癌无创筛查提供了一种具有应用潜力的工具。

4 肠道灌洗液样本DNA甲基化在结直肠癌早期诊断中的作用

结直肠癌患者的肠道灌洗液(BLF) 中含有许多脱落的肿瘤细胞,这为肠道灌洗液中DNA甲基化标志物用于结直肠癌筛查和诊断提供了可行性[30,31]。2018年,Park等从结直肠肿瘤患者和健康个体中共收集了190例肠道灌洗液样本,检测其中SDC2甲基化的情况,结果显示SDC2甲基化检测结直肠癌和绒毛状腺瘤的敏感性分别为80.0%和64.7%,特异性为88.9%[32]。上述研究表明,SDC2甲基化是癌前病变中常见的表观遗传修饰,并在肠道灌洗液样本中显示出具有诊断结直肠肿瘤的潜力。但是肠道灌洗液的效用依赖于成功的肠道准备,残余粪便等因素可能会对肿瘤来源的DNA甲基化检测产生干扰。因此,与其他需要进行肠道准备的结直肠癌检查方法进行结合,可以提高肠道灌洗液样本DNA甲基化检测的应用效果。

5 结语

综上,目前DNA甲基化标志物检测作为结直肠癌一种非侵入性的检测方法,在其早期筛查和诊断方面具有广阔的前景和巨大的临床应用潜力。同时,DNA甲基化标志物检测也面临着诸多挑战,例如,不同样本中的DNA甲基化标志物的检测结果有时与结直肠癌组织中甲基化模式表现不一致;高质量的肠道灌洗液样本依赖于良好的肠道准备,残余粪便可能会对检测结果造成一定程度的影响;以及尿液样本和肠道灌洗液样本的DNA甲基化用于结直肠癌早期诊断的大规模队列研究和应用较少等。因此,新型DNA甲基化标志物的发现、DNA甲基化检测新技术的研发及标志物检测的质量控制等仍需进一步的探索。